第二章预处理技术

1、第二章第二章 预处理技术预处理技术 2.5 离心技术离心技术 2.1 概述概述 2.2 发酵液过滤特性的改变与相对纯化发酵液过滤特性的改变与相对纯化 2.3 絮凝与凝聚絮凝与凝聚 2.4 细胞破碎细胞破碎 2.1 2.1 概述概述 生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤： 动物组织和器官动物组织和器官要先除去结缔组织、脂要先除去结缔组织、脂 肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的 溶剂形成细胞悬液。溶剂形成细胞悬液。 植物组织和器官植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎，要先去壳、除脂，再粉碎， 选择适当的溶剂形成细胞悬液

2、。选择适当的溶剂形成细胞悬液。 发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及 制成的细胞制成的细胞悬液悬液等则根据目标产物所处位等则根据目标产物所处位 置不同进行相应的处理。置不同进行相应的处理。 发酵液预处理的目的和内容发酵液预处理的目的和内容 相对纯化。相对纯化。 发酵液预处理的主要目的发酵液预处理的主要目的： *发酵液预处理的主要包括发酵液预处理的主要包括： 改变发酵液改变发酵液(培养液培养液)的物理性质，以利于的物理性质，以利于 固液分离。主要方法有加热、调整固液分离。主要方法有加热、调整pH 、 凝聚和絮凝。凝聚和絮凝。 去除发酵液去除发酵液(培养液培养液)中

3、部分杂质，以利于中部分杂质，以利于 提取和精制后继各工序的顺利进行。提取和精制后继各工序的顺利进行。 发酵液过滤特性的改变；发酵液过滤特性的改变； 2.1 2.1 发酵液过滤特性的发酵液过滤特性的 改变与相对纯化改变与相对纯化 这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难 微生物发酵液的特性为：微生物发酵液的特性为： 发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大；固体粒子可压缩性大； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为

4、非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧 化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响 成分复杂，杂质较多。成分复杂，杂质较多。 一、改善发酵液过滤特性的方法：一、改善发酵液过滤特性的方法： 1. 降低液体黏度降低液体黏度 2. 调整调整pH 3. 加入反应剂加入反应剂 4. 加入助滤剂加入助滤剂 5. 凝聚凝聚 6. 絮凝絮凝 常用的方法有加水稀释法和常用的方法有加水稀释法和加热法加热法。加水。加水 稀释法会加大后续过程的处理任务。稀释法会加大后续过程的处理任务。 1. 降低液体黏度降低液体黏度 注意事项：注意事

5、项：严格控制加热温度与时间。首先，严格控制加热温度与时间。首先， 加热的温度必须控制在不影响目的产物活性加热的温度必须控制在不影响目的产物活性 变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，变质的范围内；其次，温度过高或时间过长， 会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液 的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。 此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方 法之一，方法简单有效、成本低廉。法之一，方法简单有效、成本低廉。 如利用酸碱性来如利用酸碱性来调节调节pH值使蛋白质等两性值使蛋白质等两性 物质

6、达到等电点物质达到等电点得以除去。又如过滤中，发得以除去。又如过滤中，发 酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过 调整调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即值改变易吸附分子的电荷性质，即 可减少堵塞和污染。可减少堵塞和污染。 2. 调整调整pH 3. 加入反应剂加入反应剂 加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应 生成不溶性沉淀生成不溶性沉淀，如，如CaSO4、AlPO4等。等。 生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具 有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并

7、 且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过 滤性能。滤性能。 助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量 对过滤速度影响很大。对过滤速度影响很大。 4. 加入助滤剂加入助滤剂 助滤剂是一种助滤剂是一种不可压缩不可压缩的的多孔多孔微粒，它能微粒，它能 使滤饼疏松，滤速增大。使滤饼疏松，滤速增大。常有的助滤剂有常有的助滤剂有 硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、 炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。 助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤

8、介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入 发酵液，也可两种方法同时使用。发酵液，也可两种方法同时使用。 在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的 交换容量。交换容量。 在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受 污染，影响过滤效率。污染，影响过滤效率。 因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。 二、二、 发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化 1.高价无机离子（高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 2.杂蛋白杂蛋白 在采用离子交换和吸附

9、法提取时会降低其交换容在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容 量和吸附能力；量和吸附能力； 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象， 使两相分离不清；使两相分离不清； （一）高价无机离子的去除方法（一）高价无机离子的去除方法 2. Mg2+三聚磷酸钠三聚磷酸钠(Na5P3P10)形成形成 三聚磷酸钠镁可溶性络合物三聚磷酸钠镁可溶性络合物 1. Ca2+ 草酸、草酸、草酸钠草酸钠形成草酸钙形成草酸钙 沉淀沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸） 3.Fe2+ 黄血盐黄血盐(K4Fe(CN)6) 普鲁士蓝普鲁士蓝 沉淀沉淀 （二）杂蛋白的去除方法（二

10、）杂蛋白的去除方法 1. 沉淀法沉淀法 2. 变性法变性法 3. 吸附法吸附法 l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子， 如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味 酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子， 如如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和和Pb+等等 形成沉淀。形成沉淀。 1. 沉淀法沉淀法 2. 变性法变性法 加热，加热， 大幅度调节大幅度调节pH值，值， 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活 性剂等。性剂

11、等。 不足之处不足之处 a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物； b.极端极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要值也会导致某些目的产物失活，且要 消耗大量酸碱；消耗大量酸碱； c.有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量 较少的场合。较少的场合。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的 协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附 蛋白质；蛋白质； 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二 钠，两者生成庞

12、大的凝胶，把蛋白质、菌体及钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及 其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。 3. 吸附法吸附法 n采用凝聚和絮凝技术采用凝聚和絮凝技术能有效改变能有效改变细胞、细胞、 细胞碎片及溶解大分子物质的细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态分散状态， 使其使其聚结成较大的颗粒聚结成较大的颗粒，便于提高过滤，便于提高过滤 速率。常用于菌体细小而且粘度大的发速率。常用于菌体细小而且粘度大的发 酵液的预处理。酵液的预处理。 第三节第三节 凝聚与絮凝凝聚与絮凝 n凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破是指在某些电解质作用下，破 坏细胞，菌体和蛋白质等胶

13、体粒子的分坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分 散状态，使胶体粒子聚集的过程。散状态，使胶体粒子聚集的过程。 一、凝聚一、凝聚 概念概念 n原理：原理：发酵液发酵液(培养液培养液)中细胞、菌体或蛋白质中细胞、菌体或蛋白质 等胶体粒子的表面都带有同种等胶体粒子的表面都带有同种电荷电荷，使得这些，使得这些 胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互 相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的亲相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的亲 和性，其表面很容易吸住水分，形成一层和性，其表面很容易吸住水分，形成一层水膜水膜， 从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液从而使胶体粒子呈

14、分散状态。在发酵液(培养培养 液液)中加入电解质，就能中加入电解质，就能中和中和胶体粒子的胶体粒子的电性电性， 夺取胶体粒子表面的水分子，夺取胶体粒子表面的水分子，破坏破坏其表面的其表面的水水 膜膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。 一、凝聚一、凝聚 n阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为： Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 无机无机 盐类盐类： 金属氧金属氧 化物类：化物类： Al2(SO4)3.18H2O (明矾明矾)、 AlCl3.6H2O、FeCl3 、 ZnSO

15、4 、 MgCO3等等 Al(OH)3、 Fe3O4 、 Ca(OH)2或石灰等或石灰等 (2) 常用的凝聚剂常用的凝聚剂 n絮凝絮凝指使用絮凝剂指使用絮凝剂(通常是天然或通常是天然或 合成的大相对分子质量物质合成的大相对分子质量物质)，在悬浮，在悬浮 离子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗离子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗 大的絮凝团的过程。大的絮凝团的过程。 二、絮凝二、絮凝 概念概念 n絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物， 其相对分子质量可高达数万至一千万以上，其相对分子质量可高达数万至一千万以上， 长链状结构，其链节上含有许多活性官能长链状结构，其链节上含

16、有许多活性官能 团，包括带电荷的阴离子（如团，包括带电荷的阴离子（如-COOH） 或阳离子（如或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷）基团以及不带电荷 的非离子型基团。的非离子型基团。 n它们通过静电引力、范德华引力或氢键的它们通过静电引力、范德华引力或氢键的 作用，强烈地吸附在胶粒的表面。作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个当一个 高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同 的胶粒表面上，产生的胶粒表面上，产生桥架连接桥架连接时，就形成时，就形成 了较大的絮团，这就是絮凝作用。了较大的絮团，这就是絮凝作用。 二、絮凝二、絮凝 絮凝作用示意图絮凝作用示意图 必须具

17、有长链的线性结构必须具有长链的线性结构，以便同时与多，以便同时与多 个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子 质量不能超过一定限度，以使其具有良好质量不能超过一定限度，以使其具有良好 的溶解性。的溶解性。 分子必须含有相当多的活性官能团分子必须含有相当多的活性官能团，使之，使之 能和胶粒表面相结合；能和胶粒表面相结合； 2. 对絮凝剂化学结构的一般要求对絮凝剂化学结构的一般要求 1）有机高分子聚合物有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺，如聚丙烯酰胺 类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；类衍生物、聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物无机高分子聚合物，如聚合铝盐、，如聚合铝盐

18、、 聚合铁盐等；聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类，如聚糖类 胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多 糖、脱乙酰壳多糖等。糖、脱乙酰壳多糖等。 工业上使用的絮凝剂可分为三类：工业上使用的絮凝剂可分为三类： 3. 常用的絮凝剂常用的絮凝剂 目前最常见的高分子聚合物絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂: 有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物 根据活性基团在水中解离情况不同，可分根据活性基团在水中解离情况不同，可分 为三类：为三类： 非离子型、非离子型、 阴离子型（含有羧基）阴离子型（含有羧基

19、） 阳离子型（含有胺基）阳离子型（含有胺基） 3. 常用的絮凝剂常用的絮凝剂 聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点优点 l用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量； l絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好； l絮凝速度快；絮凝速度快； l种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。 聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点缺点 u存在一定的毒性，特别是阳离子型聚存在一定的毒性，特别是阳离子型聚 丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应 谨慎。谨慎。 4. 絮凝的影响因素絮凝的影响因素 l搅拌速度和时间：搅拌速度和时间：初期高速，接着应初期高速，接

20、着应 延长搅拌时间，降低搅拌速度。延长搅拌时间，降低搅拌速度。 l絮凝体的浓度：絮凝体的浓度：最佳添加量往往需通最佳添加量往往需通 过实验确定过实验确定 l溶液的溶液的pH：通过实验确定通过实验确定 l絮凝剂的相对分子质量：絮凝剂的相对分子质量：要适当要适当 淀粉酶发酵液中淀粉酶发酵液中 n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂， 要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过 滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过 程，称为混凝。程，称为混凝。 三、混凝三、混凝 n对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用对于带负

21、电荷的菌体或蛋白质来说，采用 阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒 双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；双电层电位和产生吸附桥架的双重机理； 第四节第四节 细胞破碎细胞破碎 一、细胞壁结构和特点一、细胞壁结构和特点 二、细胞破碎率效果的检验二、细胞破碎率效果的检验 三、细胞破碎的方法三、细胞破碎的方法 四、选择破碎方法的依据四、选择破碎方法的依据 五、破碎技术的发展方向五、破碎技术的发展方向 细胞破碎就是细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机采用物理、化学、酶或机 械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和 细胞膜，设法使胞内产物最大程

22、度地释细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释 放到液相中。放到液相中。 概念概念 微生物微生物革兰氏阳革兰氏阳 性细菌性细菌 革兰氏阴革兰氏阴 性细菌性细菌 酵母菌酵母菌霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm/nm20-8020-8010-1310-13100-300100-300100-250100-250 层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层 主要组主要组 成成 肽聚糖肽聚糖 (40-90%)(40-90%) 多糖多糖 胞壁酸胞壁酸 蛋白质蛋白质 脂多糖脂多糖 (1-4%)(1-4%) 肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%) 脂蛋白脂蛋白 脂多糖脂多糖 (11-22%)(11-22%) 磷脂磷脂 蛋

23、白质蛋白质 葡聚糖葡聚糖 （30-40%30-40%） 甘露聚糖甘露聚糖 （30%30%） 蛋白质蛋白质 (6-8%(6-8%） 脂类脂类 (8.5-13.5%)(8.5-13.5%) 多聚糖多聚糖 （80-90%80-90%） 脂类脂类 蛋白质蛋白质 一、一、 细胞壁的结构和特点细胞壁的结构和特点 u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素 的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的 细胞壁有所提高。细胞壁有所提高。 1.微生物细胞壁的化学组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构 u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的细菌破碎的主要阻力来自

24、于肽聚糖的 网状结构，网状结构越致密，破碎的难网状结构，网状结构越致密，破碎的难 度越大；度越大； u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于 壁结构交联的紧密程度和它的厚度；壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 2.植物细胞壁的化学组成和结构植物细胞壁的化学组成和结构 u成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时，生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 细胞不再增大。细胞不再增大。 u初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 纤维素分子又可进一步组装成微

25、纤丝，微纤丝纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。 u在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞 壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。 3. 细胞壁的结构与细胞的破碎细胞壁的结构与细胞的破碎 u在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细 胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎 难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、 壁厚、聚合交联程度高则难破碎。

26、壁厚、聚合交联程度高则难破碎。 二、细胞破碎效果的检查二、细胞破碎效果的检查 破碎率定义破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原被破碎的细胞的数量占原 始细胞数量的百分数，即始细胞数量的百分数，即 其中其中N0：原细胞数，：原细胞数，N：破碎后残存：破碎后残存 的正常细胞。的正常细胞。N0和和N的可通过的可通过直接测直接测 定法、目的产物测定法和测定导电率定法、目的产物测定法和测定导电率 得到。得到。 1.直接测定法直接测定法 显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把 破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 方法：样本适当稀释后，

27、通过方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术平板计数技术或或 在血球计数板上用在血球计数板上用显微镜观察显微镜观察来实现染色细胞来实现染色细胞 的技术。的技术。 平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数， 误差大；细胞聚集时，不利计数。误差大；细胞聚集时，不利计数。 2. 目标产物测定法目标产物测定法 Rm：理论最大值，：理论最大值，R：实验测得值。：实验测得值。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测 定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量 或活性，并与或活性，并与10

28、0%100%破碎率所获得的标准数值比破碎率所获得的标准数值比 较，计算其破碎率。较，计算其破碎率。 3. 测定导电率测定导电率 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释 放到水相，使导电率上升。导电率随着放到水相，使导电率上升。导电率随着 破碎率的增加而呈线性增加。破碎率的增加而呈线性增加。 导电率的大小取决于微生物的种类、处导电率的大小取决于微生物的种类、处 理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液 中原电介质的含量等，因此，正式测定中原电介质的含量等，因此，正式测定 前，应预先用其它方法测定标准曲线。前，应预先用其它方法测定标准曲线。

29、 分分 类类作用机理作用机理适应性适应性 物物 理理 破破 碎碎 高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌合丝状菌和革兰氏阳性菌 珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难分子目的产物易失活，浆液分离困难 超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作不适合大规模操作 渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率

30、较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用 反复冻融法反复冻融法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物物 干燥法干燥法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 X-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合目的产物不适合 化化 学学 破破 碎碎 酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分具有高度专一性，条件温和，浆液易分 离，溶酶价格高，通用性差离，溶酶

31、价格高，通用性差 化学渗透法化学渗透法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低，通用性差较低，通用性差 三、三、 细胞破碎的方法细胞破碎的方法（按细胞所受作用）（按细胞所受作用） 高压匀浆法高压匀浆法 珠磨法珠磨法 超声破碎法超声破碎法 渗透压法渗透压法 反复冻融法反复冻融法 干燥法干燥法 X-press法法 1. 1.物理破碎物理破碎 (1) 高压匀浆法（高压匀浆法（High-pressure homogenization） 大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法 细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间细胞悬浮液在高

32、压的作用下从阀座与阀之间 的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高 速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫 改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高 速运动过程中经历了速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到剪切、碰撞及由高压到 常压的变化常压的变化，从而造成细胞破碎。，从而造成细胞破碎。 原理：原理： 进进 口口 出出 口口 不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物： n易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌， n较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，

33、n含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬， 易损伤匀浆阀）易损伤匀浆阀） 适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于 1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细，使细 胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的 协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流协助

34、下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流 出从而实现连续操作。破碎中产生的热量出从而实现连续操作。破碎中产生的热量 一般采用夹套冷却的方式带走。一般采用夹套冷却的方式带走。 (2) 珠磨法（珠磨法（Bead mill） 工作原理：工作原理： 卧卧 式式 n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速高速 组织捣碎机、组织捣碎机、 Braun匀浆器；匀浆器； n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士 WAB公司和德国西门子机械公司制造）。公司和德国西门子机械公司制造）。

35、珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、以下：降低能耗、 减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率 产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的 困难。困难。 影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素 nb.珠体的装量珠体的装量 na.珠体的大小珠体的大小 nc.搅拌速度搅拌速度 nd.操作温度操作温度 ne.被处理细胞的特性被处理细胞的特性 实验室规模，珠径实验室规模，珠径0.2mm， 工业规模珠径大于工业规模珠径大于0.4mm 8090 适当适当 540 珠磨法的破碎率一般控制在珠

36、磨法的破碎率一般控制在80以下以下 n其原理其原理可能与可能与空空穴穴现象现象引起的冲击波和剪引起的冲击波和剪 切作用有关。切作用有关。 3.超声破碎法超声破碎法（Ultrasonication） n超生波破碎细胞时的频率一般为超生波破碎细胞时的频率一般为15 20 kHz，功率为，功率为100250W，可分为，可分为槽槽 式和式和探头直接插入介质式探头直接插入介质式两种型式。两种型式。 （3）超声波破碎法）超声波破碎法 n影响超生波破碎的因素主要有超声波影响超生波破碎的因素主要有超声波 的声强、频率、破碎时间、介质的离子的声强、频率、破碎时间、介质的离子 强度、强度、pH、菌体的浓度和种类。

37、、菌体的浓度和种类。 n一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+ 细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 超声破碎时细胞浓度一般在超声破碎时细胞浓度一般在20左右。左右。 （3）超声波破碎法）超声波破碎法 n超声波破碎法在超声波破碎法在实验室和小规模生产实验室和小规模生产中中 应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷 却到却到05，并且还应在夹套中连续通，并且还应在夹套中连续通 入冷却剂进行入冷却剂进行冷却冷却。 n另外，超声波产生的另外，超声波产生的化学自由基团化学自由基团能使能使 某些敏感性活性物质某些敏感性活性

38、物质失活失活。可以通过添。可以通过添 加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽， 或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定将细胞放在高渗透压的介质中（如一定 浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后， 转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由 于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞 内，引起细胞溶胀，甚至破裂。内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 （4 4）渗透压冲击法）渗透压冲击法（Osmotic pressureOsmotic pre

39、ssure） 仅适用于仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁 预先用酶处理或在培养过程中加入某些预先用酶处理或在培养过程中加入某些 抑制剂（如抗生素等），抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺使细胞壁有缺 陷，强度减弱。陷，强度减弱。 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓 慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于 冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂， 另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓 度变化，引起细胞膨胀而破裂。度变化，引起细胞膨

40、胀而破裂。 （5 5）反复冻融法）反复冻融法 适用于适用于细胞壁较脆弱的菌体细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较破碎率较 低，需反复多次，此外，在冻融过程中低，需反复多次，此外，在冻融过程中 可能引起某些蛋白质变性。可能引起某些蛋白质变性。 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的 渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等 对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容 易被抽提出来。易被抽提出来。 （6 6）干燥法）干燥法 气流干燥气流干燥 真空干燥真空干燥 喷雾干燥喷雾干燥 冷冻干燥冷冻干燥 气流干燥气流干燥主要适用于酵

41、母菌主要适用于酵母菌，一般在一般在25 30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥真空干燥多用于细菌多用于细菌； 冷冻干燥冷冻干燥适用于较不稳定的物质适用于较不稳定的物质。 此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至- -25 形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲以上的高压冲 击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于 冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变 形而破碎。形而破碎。 （7 7）X-pressX-press法法 该法该法主要用于实验室主要用于实验室，具有具有使用范围广、使用范围广、

42、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保 留率高留率高等优点等优点。不适用于对冷冻敏感的物不适用于对冷冻敏感的物 质。质。 酶溶法酶溶法 化学试剂化学试剂 破碎法破碎法 外加酶法外加酶法 自溶法自溶法 表面活性物质表面活性物质 EDTA螯合剂螯合剂 有机溶剂有机溶剂 变性剂变性剂 2.化学破碎化学破碎（Chemical permeation） （1）酶溶法）酶溶法（Enzymatic Lysis） 外加酶法外加酶法 常常 用用 的的 溶溶 酶酶 G+ 溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂 G- 溶菌酶、溶菌酶、EDTA 放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶 酵母菌酵母菌

43、-葡聚糖酶葡聚糖酶 霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、 植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出选择性释放产物，条件温和，核酸泄出 量少，细胞外形完整。量少，细胞外形完整。 溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种 需选择不同的酶），产物抑制的存在。需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作 用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。 酶溶法的优点：酶溶法的优点： 酶溶法的缺点：酶溶法的缺点：

44、 u缺点是：对不稳定的微生物，易引起所缺点是：对不稳定的微生物，易引起所 需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度 增大，过滤速度下降。增大，过滤速度下降。 （2）自溶法（）自溶法（Autolysis） u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自 身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。 u影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、 pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。值、缓冲液浓度和细胞代谢

45、途径等。 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质 有选择地渗透出来。有选择地渗透出来。 （2）化学试剂破碎法）化学试剂破碎法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结 构与组成。构与组成。 用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外 的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解的大部分组分

46、。酸处理可以使蛋白质水解 成游离的氨基酸。成游离的氨基酸。 如如Triton X-100是一种非离子型清洁剂是一种非离子型清洁剂， 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合 并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层， 使某些胞内物质释放出来。使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二牛黄胆酸钠、十二 烷基磺酸钠、吐温烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。等也可使细胞破碎。 表面活性剂表面活性剂 可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有 助于细胞的破碎。助于细胞的破碎

47、。 处理处理G-细菌细菌，对细胞外层膜有破坏作用。，对细胞外层膜有破坏作用。 G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子 Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维结合脂多糖和蛋白质来维 持，一旦持，一旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯合，大螯合，大 量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜 出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填 补，从而导致内层膜通透性的增强。补，从而导致内层膜通透性的增强。 EDTA螯合剂螯合剂 能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。 有机溶剂有

48、机溶剂 变性剂变性剂 盐酸胍盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和和 脲脲（Urea）是常用的变性剂。）是常用的变性剂。 常用的有机溶剂常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、：丁酯、丁醇、甲苯、 二甲苯、氯仿及高级醇等。二甲苯、氯仿及高级醇等。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的 疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 l通用性差；通用性差； l时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超 过过50% l有些化学试剂有毒有些化学试剂有毒 。 化学法的优点：化学法的

49、优点： 缺点：缺点： l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小对产物释放有一定的选择性，可使一些较小 分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过， 而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于 固液分离和进一步提取。固液分离和进一步提取。 细胞破碎方法细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）（按是否使用外加作用力） 分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性 机机 械械 法法 珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可达较高破碎率，可较大

50、规模操作可较大规模操作，大，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压匀浆高压匀浆 法法 液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可达较高破碎率，可大规模操作可大规模操作，不适，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎超声破碎 法法 液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作不适合大规模操作 X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合目的产物不适合 非非 机机 械械 法法 酶

51、溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分具有高度专一性，条件温和，浆液易分 离，溶酶价格高，通用性差离，溶酶价格高，通用性差 化学渗透化学渗透 法法 改变细胞膜的渗透改变细胞膜的渗透 性性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低，通用性差较低，通用性差 渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化冻结融化 法法 反复冻结反复冻结- -融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物物 干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条

52、件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 细胞破碎方法：细胞破碎方法： 机械法机械法 非机械法非机械法 缺点：缺点：固液分离较困难。固液分离较困难。 优点：优点：设备通用性强、破碎率高、操作设备通用性强、破碎率高、操作 时间短、成本低、大多数方法适于大规时间短、成本低、大多数方法适于大规 模生产。模生产。 缺点：缺点：破碎率低、耗时、成本高、一般破碎率低、耗时、成本高、一般 适合小规模生产。适合小规模生产。 优点：优点：固液分离容易。固液分离容易。 选择破碎方法时，需要考虑下列因素选择破碎方法时，需要考虑下列因素： 四、选择破碎方法的依据四、选择破碎方法的依据 1.

53、处理量的大小处理量的大小 2. 细胞壁细胞壁 的强度和结构的强度和结构 3. 目标产物对破碎条件的敏感性目标产物对破碎条件的敏感性 4. 破碎后固液分离的难易程度破碎后固液分离的难易程度 适宜的操作条件应从适宜的操作条件应从高的产物释放率高的产物释放率、 低的能耗低的能耗和和便于后步提取便于后步提取这三方面权衡。这三方面权衡。 五、破碎技术的发展方向五、破碎技术的发展方向 1. 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 2. 与上游技术相结合与上游技术相结合 培养过程控制培养过程控制 3. 与下游技术相结合与下游技术相结合 寄主细胞的选择寄主细胞的选择 包含体的组成包含体的组成 耐高温产品的基因表

54、达耐高温产品的基因表达 克隆噬菌体溶解基因克隆噬菌体溶解基因 第五节第五节 离心技术离心技术 离心分离离心分离 n离心分离是基于固体颗粒和周围液体密离心分离是基于固体颗粒和周围液体密 度存在差异，在离心力场中使不同密度度存在差异，在离心力场中使不同密度 的固体颗粒加速沉降的分离过程。的固体颗粒加速沉降的分离过程。 优点：优点：分离速度快，分离效率高、液分离速度快，分离效率高、液 相澄清度好。相澄清度好。 缺点：缺点：设备投资高、能耗大设备投资高、能耗大。 一、离心分离的基本原理一、离心分离的基本原理 n当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运 动物体就受到离心力的作

55、用。旋转的速动物体就受到离心力的作用。旋转的速 度越高，运动物体所受到的离心力越大。度越高，运动物体所受到的离心力越大。 如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进 行高速水平旋转，在相同转速条件下，行高速水平旋转，在相同转速条件下， 容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶 质会以不同的速率沉降。质会以不同的速率沉降。 定义：颗粒在单位离心力场中移动的距离。定义：颗粒在单位离心力场中移动的距离。 相对离心力相对离心力（Relative centrifugal force）（）（RCF）是指在离心场中作用是指在离心场中作用 于颗粒的离心力相

56、当于地球重力的倍于颗粒的离心力相当于地球重力的倍 数。数。 相对离心力：相对离心力： RCF =r2/g =2n2r/900g 1. 1.离心力与相对离心力离心力与相对离心力 定义：颗粒在单位离心力场中粒子移定义：颗粒在单位离心力场中粒子移 动的速度。沉降系数是以时间表示的动的速度。沉降系数是以时间表示的。 s =2.303(lgx2-lgx1) /2(t2-t1) 2. 2.沉降系数沉降系数（sedimentation coefficient，s） 定义：在离心力下，单位时间内物质定义：在离心力下，单位时间内物质 运动的距离。运动的距离。 3.3.沉降速度沉降速度 4. 4.沉降时间沉降时间

57、 t2-t1 =lnr2/r1 /s2 定义：离心分类机转鼓内的悬浮液或定义：离心分类机转鼓内的悬浮液或 乳浊液在离心场中所受的离心力与其乳浊液在离心场中所受的离心力与其 重力的比值，即离心加速度与重力加重力的比值，即离心加速度与重力加 速度的比值。速度的比值。 5. 5.分离因数分离因数 Fr =R2/g=2Rn2/900g 分离分离时，要根据所分离物质以及杂质分离分离时，要根据所分离物质以及杂质 的大小、密度和特性的不同选择适当的离的大小、密度和特性的不同选择适当的离 心机、离心方法和离心条件。心机、离心方法和离心条件。 二、离心分离纯化的分法二、离心分离纯化的分法 差速离心法差速离心法

58、速率区带离心法速率区带离心法 等密度离心法等密度离心法 （1）差速离心法）差速离心法 n通过控制通过控制不同的离心力和离心时间不同的离心力和离心时间，使，使 沉降速度不同的颗粒沉降速度不同的颗粒逐级分离的方法。逐级分离的方法。 操作时选用悬浮液来进行分离，先选择操作时选用悬浮液来进行分离，先选择 好离心力和离心时间，使悬浮液中最大好离心力和离心时间，使悬浮液中最大 的颗粒先沉淀，取出上清液，然后加大的颗粒先沉淀，取出上清液，然后加大 离心力再进行分离，沉淀出较小的颗粒，离心力再进行分离，沉淀出较小的颗粒， 如此多次分离，达到逐级分离的目的。如此多次分离，达到逐级分离的目的。 （1）差速离心法）

59、差速离心法 n差速离心法的分辨率不高，沉降系数差速离心法的分辨率不高，沉降系数 在同一个数量级内的各种粒子不易分在同一个数量级内的各种粒子不易分 开，常用于粗制品的提取，如细胞匀开，常用于粗制品的提取，如细胞匀 浆中细胞器的分离。浆中细胞器的分离。 （2）速率区带离心法）速率区带离心法 n也称一般密度梯度离心法，是在离心管中事也称一般密度梯度离心法，是在离心管中事 先加入某种低分子溶液先加入某种低分子溶液(蔗糖、甘油等蔗糖、甘油等)，调，调 配好配好密度梯度密度梯度，在密度梯度溶液得顶部加待，在密度梯度溶液得顶部加待 处理得样品，然后离心，使沉降系数比较接处理得样品，然后离心，使沉降系数比较接

60、 近得物质得以分离得一种区带分离方法。近得物质得以分离得一种区带分离方法。 n梯度介质不与目的组分反应，不引起分离组梯度介质不与目的组分反应，不引起分离组 分得变性、失活。用于形成密度梯度介质很分得变性、失活。用于形成密度梯度介质很 多，较常用得是蔗糖、甘油、硅胶等。多，较常用得是蔗糖、甘油、硅胶等。 步骤：步骤： 1)在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的 密度从离心管顶部至底部逐步增加（正密度从离心管顶部至底部逐步增加（正 梯度）梯度） 2)将所需分离的样品小心地加至密度梯度将所需分离的样品小心地加至密度梯度 溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成溶液的顶部。样品