胚胎冷冻保存

1、冷冻保存技术-胚胎 冷冻保存 胚胎冷冻保存是将胚胎保存在-196超低温的液氮 （或其他抗冻保护剂）中做长期保存。可使胚胎移植不 受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率，长期 保存优良基因的目的。胚胎冷冻技术为建立优良品种的 胚胎库提供了条件，还可以长期保存珍贵或濒临灭绝的 动物资源。 研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要 的意义。 v胚胎冷冻保存原理 v胚胎冻存的损伤机制 v抗冻保护剂 v胚胎冷冻方法 v人类胚胎冷冻案例 胚胎冷冻保存原理 v冷冻保存冷冻保存,是将体外培养物悬浮在加有或小加是将体外培养物悬浮在加有或小加 冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降冷冻保护剂的溶液中，

2、以一定的冷冻速度降 至零下某一温度，对其长期保存的过程至零下某一温度，对其长期保存的过程。此 时细胞的代谢活动被完全抑制，使细胞的生 命在静比状态下保存来，从而达到长期保存 的目的。 胚胎冻存的损伤机制 v胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程，冷冻保存的关冷冻保存的关 键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。正常 胚胎细胞内水分含量达80%以上，在冷冻过程中， 胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶， 一方而对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤，另 一方而导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高， 造成蛋自质变性即溶液损伤，二者最后都导致胚胎 小可逆性变化而死亡

3、。 抗冻保护剂 v胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚 胎的损伤。对于胚胎的冷冻和解冻，一50- 15是一个致死温度区。在这个温度区细胞 容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免加入抗冻保护剂能避免 冰晶的形成。冰晶的形成。 v分类：渗透型冷冻保护剂 非渗透性冷冻保护剂 渗透型冷冻保护剂 v属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0 以上很容易通过细胞膜进入细胞质。 v机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞 内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂 与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度 从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。 v常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜 （DMS

4、O）、丙二醇和乙二醇等。 非渗透型冷冻保护剂 v属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质， 能够溶解于水，但不能进入细胞。 v机理：非渗透型冷冻保护剂主要通过该改变 渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作 用。 v常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。 冷冻方法 v冷冻保护液常用pH7.27.4的磷酸盐缓冲液（PBS） 来配制，也可用生理盐水或M199来配制。 v现有保存方法有3种：程序冷冻法：一步冷冻法和 玻璃化冷冻化。 v在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保 护剂；快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冷冻保 护剂，如甘油、

5、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二 醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。 程序冷冻法 v也叫慢速冷冻法、逐步降温法。 v所用冷冻保护剂一般为： 二甲亚砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、 1,2-丙二醇等。该法采用较低浓度的冷冻保护剂， 对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操 作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊 的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此 法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 v影响因素包括：抗冻保护剂的选择与浓度、植冰和 降温速度、解冻方法、抗冻的脱出等 v大致基本步骤如下： v将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次 v讲洗涤过的胚胎在室温条件

6、下加入含1.4mol|L甘油和20%小 牛血清的PBS的冷冻中平衡20min v将胚胎和冷冻液装入0.25ml胚胎冷冻细管中，封口，并在细 管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等 v将装入胚胎的习惯放入冷冻仪中，在0平衡10min，以 1|min的速度降至-7-6，并在此温度下诱发洁净，平衡 10min，然后0.3的速度降温至-38-35，投入液氮保存 v解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10s， 立即至于37水浴解冻，1min后取出完成解冻过程 v将细管中的冷冻液及胚胎推出，在现实镜下找到胚胎并移入 解冻液。采用三步法脱除甘油，每步57min。最后用PBS 液将胚胎洗35遍，

7、供移植备用。 一步冷冻法 v也叫一步细管法。 v该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的 冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内 用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于 在生产中推广应用。 玻璃化冷冻法 v将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后， 直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度 时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液 态变为透明的固态，形成玻璃化。 v用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后 分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是 一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪 器。 v是近年来发展起来的一种新的方法。 v大致基本步骤如下： v将胚胎在含20%小

8、妞血清的PBS溶液中清洗两次 v将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油 和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10min v将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS 溶液中，立即转入胚胎冷冻细管 v将细管在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存 v解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速 投入20温水中，摇动细胞管使其解冻均匀 v将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的 PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小 牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植 人类胚胎冷冻案例 v一. 研究对象:白2 000年1月至20 O 1年7月止，于本室进行I

9、V F- E T治疗的患者 22例共行冷冻胚胎移植24个周期，年龄24 31岁，平均年龄(28士2. 96)岁，不 孕年限110年，平均不孕年限( 3. 5士2. 23)年。其中临床激素替代周期7个周期， 白然周期17个周期。 v 二、胚胎冷冻:22例患者按本室常规进行IVF一ET治疗。胚胎移植术后，从剩 余胚胎中选择优质胚胎分别放入含25%人血白蛋白的DPBS缓冲液5分钟、1. 5M PROH液10分钟、1. 5M PROH+0. 1M Sucrose液5分钟，然后迅速装管，总操 作时问不超过20分钟。最后将胚胎迅速放入程序冷冻仪( Cryo L一863，澳大利 亚)中进行程序冷冻，程序为:

10、从22开始，以一2 0C/分钟的速度降至一6 0C,停 留5分钟，进行人工植冰，然后继续停留10分钟，再以一0. 3的速度降至一 37，以一0.6/分钟降至一40 ，然后将胚胎转移入液氮中。 v 22例患者共进行了24个周期的胚胎冻融移植，共获得临床妊娠5例，临床妊娠 率为22.7% 二. 20 06年2月一20 07年12月在我中心进行冷冻胚胎移植患者112例，年龄 2339岁，平均(30 88士3 72)岁。不孕年限117年，平均(4 79士3 24)年。其中 85例患者年龄50%为存活胚胎。 三. 1.研究对象 1999年12月一2001年12月在本生殖医学中心，应用卵细胞内单精 子显微

11、注射(ICSI)及常规体外受精(IVF)技术治疗不育不孕症的71个周期中，将胚 胎移植后剩余的优质胚胎进行冷冻保存。 2.治疗方法术前检查夫妇双方的染色体核型正常，血液促黄体生成素(LH)水平 在正常范围。患者妻子从月经黄体中期开始采用GnRH-a-FSH-HMG-hCG方案进 行超促排卵。采用常规NF和ICSI技术进行体外受精和胚胎移植。 3.胚胎冷冻采用慢速、逐步降沮的冷冻程序，以丙二醇、蔗糖为冷冻保护剂， 用CL一3000程序冷冻仪进行程序冷冻，然后将胚胎贮存于液氮中。冷冻程序:室 温以一1 /min到一69C;浸润I mln，植冰，再保温9min;以一0. 39C/min到一3290; 一0. 29C/min到一369C;一19C/min到一759C结束。 4.胚胎解冻及移植胚胎复苏的方法采用快速解冻法。解冻液以PBS、丙二醉、 蔗糖为原料以适当的比例进行配制。在女方自然月经周期尿LH峰的第3天或第4 天将冷冻胚胎复苏，将复苏后胚胎在墙养箱中培养2一4b,选择有半数以上细胞成 活的胚胎进行移植。移植2周后进行妊振试验,4周后B超检查有无孕囊及胎心搏动。 5.结果 在71个胚胎冷冻贮存周期中，25个周期已经妊振。在另外46个周期 中，进行冷冻胚胎复苏后移植的有24个