第四章 DNA replication

1、第四章第四章 DNA replicationDNA replication 4.1 4.1 复制体系复制体系 复制体系复制体系 复制原点，起始因子复制原点，起始因子 DNA polymerase 引发酶（引发酶（primase） 其他蛋白质和酶其他蛋白质和酶 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 单链结合蛋白单链结合蛋白 DNA连接酶连接酶 1 1， 复制原点，起始因子复制原点，起始因子 起始复制的位置叫复制原点（起始复制的位置叫复制原点（origin)origin) 常用常用 oriori来表示。来表示。 6 6个复制原点个复制原点 复制叉（复制叉（replication forkreplicatio

2、n fork） 复制泡复制泡 ( (replication bubblereplication bubble) ) O replication replication forkfork replication replication bubblebubble 再启动现象再启动现象 复制泡中有复制泡复制泡中有复制泡 1 1）E.E.colicoli. . 的复制原点的复制原点 oriori C C oriori C C 245245bpbp 特点：特点： A TA T的含量高；的含量高； 存在存在9-149-14个个GATC GATC 位点，其中位点，其中A A的甲基化非常重要；的甲基化非常重要

3、； 识别位点识别位点R1, R2, R3, R4R1, R2, R3, R4高度保守，高度保守， A TA T的含量更高。的含量更高。 R1 R2 R3 R4R1 R2 R3 R4 4 4个个9 9聚体形成的识别位点聚体形成的识别位点 每个每个9 9聚体含聚体含9 9 个个bpbp 3 3个个1313聚体聚体 R1: R1: TGTGGATAA (AT (AT含量含量6/9)6/9) R2: R2: TTATACACA (AT (AT含量含量7/9)7/9) R3: R3: TTTGGATAA (AT (AT含量含量7/9)7/9) R4: R4: TTATCCACA (AT (AT含量含量6

4、/9)6/9) R1R1与与R2R2互为完全反向重复序列互为完全反向重复序列 R1: R1: TGTGGATAA ACACCTATT R4: R4: TTATCCACA AATAGGTGT R1R1与与R3R3 部分正向重复部分正向重复 R1: R1: TGTGGATAA R3: R3: TTTGGATAA R2R2与与R4R4部分正向重复部分正向重复 R2: R2: TTATACACA R4: R4: TTATCCACA R1, R2, R3, R4R1, R2, R3, R4构成了构成了E.E.colicoli. . 的复制酶识别因子的复制酶识别因子 的识别位点，为的识别位点，为E.E.c

5、olicoli. . 的复制不可缺少。的复制不可缺少。 识别因子识别因子 与延长有关与延长有关 识别因子与识别位点相结合识别因子与识别位点相结合 （ Binding of the recognition factor to the recognition siteBinding of the recognition factor to the recognition site） 2 2）噬菌体的噬菌体的oriori ori 350bp ori1 ori2 ori3 ori4 每个每个1919bpbp ATAT富含序列富含序列 AT80% AT80%回文序列回文序列 4 4个正向重复的个正向重复

6、的ori序列序列 GTCAGAGAATTCGAATCCTCTGAC CAGTCTCTTAAGCTTAGGAGACTG 识别因子为识别因子为O O蛋白。蛋白。 噬菌体的正常复制噬菌体的正常复制 需要需要4 4个个ori序列全部序列全部 被被OO蛋白饱和。蛋白饱和。 3 3）T7噬菌体的噬菌体的oriori Gene 1 Gene 1.1 T7T7噬菌体的噬菌体的oriori 微生物经济节约的特点又一体现微生物经济节约的特点又一体现 包括包括Gene 1.1Gene 1.1的的2 2个启动子个启动子 61 61bpbp的的ATAT富含序列富含序列 识别因子为识别因子为gp2.5gp2.5 4 4）

7、P4噬菌体的噬菌体的oriori P4噬菌体是温和型噬菌体（噬菌体是温和型噬菌体（temperate phagetemperate phage） oriori包括包括6 6个重复的个重复的TGTTCACCTGTTCACC 识别因子为识别因子为蛋白蛋白 蛋白有三种功能蛋白有三种功能 识别因子识别因子 引发酶引发酶 螺旋酶螺旋酶 5 5）SV40病毒病毒的的oriori 反向重复序列反向重复序列 ATAT富含序列富含序列 Site 1Site 2 回文序列回文序列 Site 2 反向重复序列反向重复序列( (其中其中GAGGCGAGGC是是T T抗原的识别位点抗原的识别位点) ) ATAT富含序列

8、（解链的位点）富含序列（解链的位点） T T抗原是识别因子抗原是识别因子 T T抗原只结合抗原只结合Site 2， 起始起始40-50%的复制能力；的复制能力； T T抗原结合抗原结合Site 2和和Site 1 ， 起始起始100%的复制能力。的复制能力。 回文序列（功能不知）回文序列（功能不知） 6 6）酵母酵母的的oriori 酵母酵母的自主复制序列的自主复制序列 （autonomously replicating sequence, ARSautonomously replicating sequence, ARS） B3 B2 B1 A C ABF 1ORC A:A:具有具有ARSA

9、RS的共有序列的共有序列ACS: (T/A)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A)ACS: (T/A)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A) 所有所有ARSARS都有都有ACS, ACS, 是识别因子是识别因子ORC的的识别位点。识别位点。 B1, B2:B1, B2:可能是可能是DNADNA的解链位点。的解链位点。 B3: B3: 是结合蛋白是结合蛋白ABF 1的的结合位点。结合位点。 C:C:只有微弱的起始活性。只有微弱的起始活性。 ABF 1是一个多功能、是一个多功能、 序列专一的序列专一的结合蛋白。结合蛋白。 序列专一是指它只结合序列专一是指它只结合B3; 多功能是指它既是

10、复制因子，多功能是指它既是复制因子， 又是转录因子又是转录因子 7 7）复制原点的特点）复制原点的特点 ATAT富含富含 多种重复序列多种重复序列 反向重复（回文序列）反向重复（回文序列） 正向重复正向重复 经济节约的原则经济节约的原则 （既作为复制原点，（既作为复制原点， 又作为启动子）又作为启动子） 复制原点的序列呈多样性复制原点的序列呈多样性 3UT R Genome Replicase ? 复制原点在哪里？复制原点在哪里？ 8 8）搜索复制原点）搜索复制原点 传统的方法传统的方法- -分子生物学实验手段分子生物学实验手段 突变突变+ +表型观察（复制是否进行）表型观察（复制是否进行）

11、现代的方法现代的方法- -生物信息学结合分子生物学实验手段生物信息学结合分子生物学实验手段 位点搜索位点搜索+ +定点诱变定点诱变+ +表型观察表型观察 （复制是否进行）（复制是否进行） （复制受影响的程度）（复制受影响的程度） 3UT R Replicase 复制原点在哪里？复制原点在哪里？ Genome 复制酶长期在基因组一个不变的区域内结合，复制酶长期在基因组一个不变的区域内结合， 就会在这个区域内留下历史的痕迹。就会在这个区域内留下历史的痕迹。 找到这个痕迹，就找到了复制原点。怎麽找？找到这个痕迹，就找到了复制原点。怎麽找？ 所谓所谓“历史的痕迹历史的痕迹”在核酸的一级结构上实际上就是

12、在核酸的一级结构上实际上就是 一段碱基的特殊的排列组合，这一段碱基的排列组合一段碱基的特殊的排列组合，这一段碱基的排列组合 使复制酶在此结合最稳定，即结合的自由能最小。使复制酶在此结合最稳定，即结合的自由能最小。 “历史的痕迹历史的痕迹”就是一段结合自由能最小的碱基排列组合就是一段结合自由能最小的碱基排列组合 SEQ 1( CAP) 207 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ 1( CAP) 207 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ 2( CON-TREM.UK) 162 CAGCACTTTAGCTGGACAGAASEQ 2( CON-TREM.UK) 162

13、CAGCACTTTAGCTGGACAGAA SEQ 3( RIEMS,C) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ 3( RIEMS,C) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ 4( CHINESE) 221 TAAGGTAATTTCTAACGGCCCSEQ 4( CHINESE) 221 TAAGGTAATTTCTAACGGCCC SEQ 5( ALFORT-187) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ 5( ALFORT-187) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ 6( P97) 162 CAGCACT

14、TTAGCTGGAGGGAASEQ 6( P97) 162 CAGCACTTTAGCTGGAGGGAA SEQ 7( D4990.I) 162 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAASEQ 7( D4990.I) 162 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAA SEQ 8( GLENTORF) 162 AGCACTTTAGCTGGAAGGAAASEQ 8( GLENTORF) 162 AGCACTTTAGCTGGAAGGAAA SEQ 9( ALFORT-A19) 20SEQ 9( ALFORT-A19) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC AAGGTAATTTCCTA

15、ACGGCCC SEQ10( GPE-) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ10( GPE-) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ11( 19.SK) 161 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAASEQ11( 19.SK) 161 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAA SEQ12( SHIMEN) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ12( SHIMEN) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ13( HCLV) 218 TAAGGTAATTTCTAACGGCCCSEQ13( HCLV) 218

16、TAAGGTAATTTCTAACGGCCC SEQ14( MOORE.UK) 162 CAGCACTTTAGCTGGAAGGAASEQ14( MOORE.UK) 162 CAGCACTTTAGCTGGAAGGAA SEQ15( ALD) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCCSEQ15( ALD) 208 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ16( OLD-LEDER.US) 162 CAGCACTTTAGCTGGAAGGAASEQ16( OLD-LEDER.US) 162 CAGCACTTTAGCTGGAAGGAA SEQ17( BRESCIA) 207 AAGGT

17、AATTTCCTAACGGCCCSEQ17( BRESCIA) 207 AAGGTAATTTCCTAACGGCCC SEQ18( ALFORT) 207 AGGTAATTTCCTAACGGCCCCSEQ18( ALFORT) 207 AGGTAATTTCCTAACGGCCCC SEQ19( U744.D) 162 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAASEQ19( U744.D) 162 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAA SEQ20( A.SK) 161 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAASEQ20( A.SK) 161 CAGCACTTTAGCTGGAGGAAA 微生物

18、种类的名称微生物种类的名称 复制原点复制原点的序列的序列 复制原点的复制原点的位置位置 2，DNA polymerase 1 1）不能）不能从头起始从头起始（de novo initiation） 2 2）以）以dATPdATP, , dGTPdGTP, , dCTPdCTP, , dTTPdTTP 为底为底物物 3 3）需要模板）需要模板 4 4）对模板高度忠实性）对模板高度忠实性 严格地配对严格地配对 及时地修复及时地修复 5 5）种类多样，组成复杂）种类多样，组成复杂 6 6）需要其它因子参与）需要其它因子参与, , 要模板要模板 7 7）高度的进行性）高度的进行性 8 8）一致的空间结

19、构，相似的作用机理）一致的空间结构，相似的作用机理 原核的三种原核的三种 P Polol P Polol P Polol 真核的五种真核的五种 PolPol PolPol PolPol PolPol PolPol DNA polymerase 的的结构模型结构模型 手指手指 手掌手掌 拇指拇指 手指手指 拇指拇指 手掌手掌 （活性中心）（活性中心） 模板进入模板进入 外切酶外切酶 活性区活性区 T7 DNA polymerase 的晶体结构模型的晶体结构模型 手指手指 拇指拇指 模板进入模板进入 手掌手掌 （活性中心）（活性中心） 外切酶外切酶 活性区活性区 3，引发酶（引发酶（primase

20、） 一种一种RNARNA聚合酶聚合酶 1) 1) T7 T7 噬菌体噬菌体primase 基因基因4 4的产物（的产物（gp4), 566aa, 63 gp4), 566aa, 63 KDaKDa 合成引物的长度为合成引物的长度为4-54-5 引物序列一般为引物序列一般为pppACpppAC(N)(N)2-3 2-3 识别位点的序列为识别位点的序列为 CTGCTG gp4 gp4 有有两种功能两种功能 primase helicase 2) 2) E.E.colicoli. . primase 基因基因dnaGdnaG的产物的产物, 581aa, 60 , 581aa, 60 KDaKDa 合

21、成引物的长度为合成引物的长度为10-1210-12 引物序列一般为引物序列一般为pppAGpppAG( (N)N)8-10 8-10 识别位点的序列为识别位点的序列为 CTGCTG 需要需要helicase的的辅助辅助 3) 3) T4 T4 噬菌体噬菌体 primase 基因基因6161的产物（的产物（gp61), 342aa, 44 gp61), 342aa, 44 KDaKDa 合成引物的长度为合成引物的长度为4-54-5 引物序列一般为引物序列一般为pppACpppAC( (N)N)2-3 2-3 识别位点的序列为识别位点的序列为 GTTGTT gp61 gp61常与常与gp41gp41（helicase）形成复合体而工作形成复合体而工作 3) 3) Yeast Yeast primase 由由2 2个亚基组成，个亚基组成，62 62 KDaKDa， 48 48 KDaKDa 合成引物的长度为合成引物的长度为8-108-10 引物序列一般为引物序列一般为pppppp(A/G)(A/G)( (N)N)7-9 7-9 无特别的识别序列无特别的识别序列 与与 Pol形成复合体而工作形成复合体而工作 ) ) 小结小结 引物一般为引物一般为RNARNA 引物比较短引物比较短 有特定