第七章 分子发光分析法

1、第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法 本章教学内容：本章教学内容： 7.1 概述 7.2 分子荧光分析法 7.3 分子磷光分析法 7.4 化学发光分析法 7.5 实验技术 7.6 应用 1 7.1 7.1 概述概述 2 有些物质受到光照射时，会吸收特定波长的光，即有些物质受到光照射时，会吸收特定波长的光，即 会吸收光谱，除此之外，还会发射出比原来吸收波长会吸收光谱，除此之外，还会发射出比原来吸收波长 更长的光。当激发光停止照射后，这种光若随之很快更长的光。当激发光停止照射后，这种光若随之很快 消失，叫荧光；若激发光停止后仍可持续发光一段时消失，叫荧光；若激发光停止后仍可持续发光一段时 间

2、，叫磷光。荧光和磷光都属于光致发光。间，叫磷光。荧光和磷光都属于光致发光。 还有电致发光、化学发光、生物发光等。还有电致发光、化学发光、生物发光等。 由于物质分子结构不同，所吸收光的波长及发射由于物质分子结构不同，所吸收光的波长及发射 的荧光波长也不同。利用物质的荧光谱线位置的不同的荧光波长也不同。利用物质的荧光谱线位置的不同 可以定性鉴别物质；同种物质的浓度不同，所发射的可以定性鉴别物质；同种物质的浓度不同，所发射的 荧光强度不同，利用这个性质可以定量分析。这种分荧光强度不同，利用这个性质可以定量分析。这种分 析法叫荧光分析法。析法叫荧光分析法。 荧光法最主要的优点之一是灵敏度高。紫外吸收法

3、荧光法最主要的优点之一是灵敏度高。紫外吸收法 的灵敏度为的灵敏度为10-7 g/mL，而荧光法可达而荧光法可达10-10 10-12 g/mL。 对于有机化合物，荧光法的选择性高于紫外吸收法。对于有机化合物，荧光法的选择性高于紫外吸收法。 因此，荧光法在生物化学、环境科学、医药学、食品因此，荧光法在生物化学、环境科学、医药学、食品 分析、卫生检验、农林牧产品分析和科研领域中具有特分析、卫生检验、农林牧产品分析和科研领域中具有特 殊的重要性。殊的重要性。 分类分类 根据激发光根据激发光 波长范围波长范围 根据待测物质根据待测物质 的存在形式的存在形式 X射线荧光分析法射线荧光分析法 紫外紫外-可

4、见荧光分析法可见荧光分析法 红外荧光分析法红外荧光分析法 分子荧光法分子荧光法 原子荧光法原子荧光法 本章主要介绍分子的紫外本章主要介绍分子的紫外-可见荧光。可见荧光。 7.2.1 分子光谱的产生分子光谱的产生-电子自旋的多重性电子自旋的多重性 多重性（多重性（multiplicy, M）：电子自旋的状态 单重态单重态(singlet state, S)：分子中所有电子自旋都相反配对的电子态(M=1) 三重态三重态(triplet state, T)：分子中电子对的电子自旋平行的电子态(M=3) 7.2 7.2 分子荧光分析法分子荧光分析法 M M 的的 基基 态态 与与 激激 发发 态态 3

5、s 3p 12 SM 5 S0 S1 T1 M=1 M=1 M=3 S-电子的总自旋量子数电子的总自旋量子数 对同一物质，物质所处的多重态不同，性质明显不同 1S态磁场中不分裂，抗磁性；T态分子磁场中分裂，顺磁性; 2 电子在不同的（单、多重）态间跃迁需换向，不易发生; 3 各状态能量高低： S2T2S1T1S0 4 S0T1跃迁禁阻，但是S1 和 T1发生互换后，T1 S0跃迁可产 生磷光； Jablonski 能级图能级图 6 1. 振动驰豫振动驰豫 (vibrational level relaxation, VR) Jablonski 能级图能级图 2. 内转换内转换(internal

6、 conversion, IC) 7. 外转换外转换(external conversion, EC) 分子的去激发过程分子的去激发过程 （绿色虚线）（绿色虚线） 4. 系间窜跃系间窜跃(intersystem crossing, ISC) （黑色虚线）（黑色虚线） 7 5. 分子荧光分子荧光 (vibrational level relaxation, VR) Jablonski 能级图能级图 6. 延迟荧光延迟荧光(prompt fluorescence) 7. 分子磷光分子磷光(delayed fluorescence, DF ) 分子的去激发过程分子的去激发过程 8 1 荧光激发光谱荧

7、光激发光谱 固定发射波长em ，扫描激发波长ex而获 得的荧光强度If -激发波长的关系曲线； 反应了不同激发波长激发荧光的相对效率； 7.2.2 分子荧光的性质分子荧光的性质 Ifex 2 荧光发射光谱荧光发射光谱 固定激发波长em ，扫描发射波长em而获 得的荧光强度If -发射波长的关系曲线； 反应了不同发射波长激发荧光的相对效率； Ifem 本质：吸收光谱 本质：荧光发射光谱 Ifex和Ifem可组成两维 光谱，用于选择条件。 9 a) 单色器改变em，同一荧光物质Ifex曲线形状不变，只是灵敏度有变 化，即曲线高低变化； b) 理论上，ex(max)和和 abs (max) 相等，激

8、发光谱和吸收光谱相同； a) 荧光光谱的形状(Ifem曲线)和激发 波长ex无关， b) 分子荧光的em总比其相应的ex长，这 种波长的位移表明荧光激发和发射之间的 能量损失，称为Stokes位移； c) 荧光光谱和吸收光谱有镜像关系 (mirror image) 荧光激发光谱特点：荧光激发光谱特点： 荧光（发射）光谱特点荧光（发射）光谱特点: 10 7.2.3 分子荧光的参数分子荧光的参数 1 荧光寿命荧光寿命 (fluorescence lifetime) 2 荧光量子产率荧光量子产率 f(quantum efficiency) 反映了荧光物质发射荧光的能力； 处于激发态的荧光体返回基态之

9、前停留在激 发态的平均时间，用表示；激发态分子数 目衰减到原来的1/e时所经历的时间。 当 t=, 有63激发态分子去激 实验测定实验测定：ln(I0/It)t作回归曲线， 斜率1/ 便可求出便可求出 11 1 1 荧光强度与浓度荧光强度与浓度 荧光分析是微量组分或痕量组分 分析方法，当浓度增至吸光度 A 0.05，产生浓度效应和自吸效 应，If与c的关系偏离线性！ 7.2.4 荧光强度的主要影响因素荧光强度的主要影响因素 KcbcI AIAII A xex eI IIII f fff x A f A fff 0 00 3032 0 00 3032 3032303211 050 1050 1

10、101 . .( ,. ,. )( )()( . 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素 12 什么分子产生荧光？什么分子产生荧光？ 强荧光分子都具有大的共轭键以及供 电子取代基和刚性平面结构， 什么分子不产生荧光？什么分子不产生荧光？ 饱和化合物与只有孤立双键的化合物 2 荧光与分子结构荧光与分子结构 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素 13 （1 1）共轭）共轭 键体系键体系 荧光最强，环越大，发光越强，发光峰红移程度越大 共轭环数相同的芳香族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性长 14 短 长 （2 2）刚性平面结构）刚性平面结构 i) 强荧光分子多具有刚性平面结构：减少自身的振动，与溶

11、剂分子或其他 溶质的作用减少，较少碰撞几率； ii) 很多同分异构体的反式具有 平面结构，通常为荧光物质，而 顺式非平面结构不发荧光。 C C H H C C H H cis-trans- 15 f-荧光量子产率 0f1 （3 3）取代基效应）取代基效应 供电子取代基使荧光加强 基团：NH2，NHR，NR2，OH，OR，CN等 n电子云与芳环上的电子轨道平行，形成了p 共轭，扩大共轭体系。但 是基团中的n电子转化为共盐后，它们的荧光均大为减弱。 16 吸电子取代基使荧光减弱，磷光增强 基团：COOH，CO，NO2，SH及重氮基等。 n电子云并不与芳环上的电子云共平面，不能构成 p共轭，荧光发射

12、弱； 重原子效应：而芳环上取代卤素后系间窜跃较为强烈，相应荧光随卤数原子量 的增加而减弱，磷光相应增强。 17 （4 4）电子跃迁类型）电子跃迁类型 含O、N、S等杂原子的有机物如喹啉和芳酮类化合物含有非键电子n，电 子跃迁多为n*型，系间窜跃强，荧光很弱或不发荧光； 不含含O、N、S原子的有机体多发生 *类型跃迁，荧光辐射强！ 3 荧光猝灭荧光猝灭 荧光猝灭（fluorescence quenching）：荧光分子与溶剂或其他物质分 子作用使荧光强度减弱的现象 猝灭剂（quencher）：能使荧光猝灭的物质 静态猝灭： 动态猝灭： MQQM 基态荧光分子M和猝灭剂Q反应生成非荧光物质MQ )

13、( )( * 荧光荧光 无辐射跃迁无辐射跃迁 em MQ MQMQQMM ex 激发态M*和Q碰撞发生能量转移而失去荧光性 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素 18 常见的猝灭类型常见的猝灭类型 （1） 自猝灭：自猝灭： i.荧光物质分子M*和它的基态M碰撞引起猝灭； ii.荧光物质的自吸收，S1激发态的分子发射的荧光被处于基态 M的分子所吸收，使荧光强度降低。 荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二 聚体或多聚体，或者激发态分子S1与基态分子M形成激发态 二聚体1(M*M)。 （2）电荷转移猝灭：）电荷转移猝灭： 激发态分子发生氧化还原反应 )em()( * *ex 322

14、2 FeMFeMFe MMMFe ，有有 荧光荧光甲基蓝甲基蓝，无无 19 （3） 转入三重态猝灭转入三重态猝灭 经系间窜跃进入三重态的分子，多余的能量消耗在碰撞之中使荧光猝灭。 溴化物和碘化物由“重原子效应” ，促使荧光分子的激发单重态转入激 发三 重态，导致荧光的猝灭； 氧分子也会增强使荧光物质系间窜跃，氧分子是荧光最常见的 猝灭剂。 （4） 光化学反应猝灭光化学反应猝灭 某些光敏物质在紫外或可见光的照射下易发生化学反应或预离解跃迁； DNA、多糖类和蛋白质等物质在UV和VIS下可引起光解作用。 光黄素光黄素）核黄素（维生素核黄素（维生素 VisorUV B2 20 4. 温度、酸度、溶剂

15、和表面活性剂的影响温度、酸度、溶剂和表面活性剂的影响 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素 温度温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。 温度降低，分子运动速度变慢，从而使荧光和磷光分子与溶剂分子 或其它分了的碰撞机率减小，f 和 If 都增大 特别是对于分子磷光，室温下很难观 察到磷光，一般分子磷光都是在低温 下测定！ 21 pH值值改变会影响弱酸或弱碱的型体分布，进而影响荧光强度； 在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值: 溶剂的极性改变溶剂的极性改变也也会使荧光物质 的f发生变化； 荧光探针 （fluorescence probe） 对溶液极性敏感。 表面活性剂的影响表面活性剂的影响

16、 表面活性剂的浓度增大到CMC时，单体缔结成胶束，保护荧光质 点，减小猝灭，使f增大，荧光增强。 CMC-临界胶束浓度 22 7.2.5 荧光定量分析法荧光定量分析法 （1）工作曲线法）工作曲线法 将标准物质配成一系列标准溶液c并测定它们的相对荧光强度If，以 If 对c进行线性回归得到工作曲线。 （2）比较法）比较法 纯物质：cs、Ifs、If0 试液： cx、Ifx s ffs ffx x c II II c 0 0 23 （3）荧光猝灭法）荧光猝灭法 对于静态猝灭： 对于一定浓度的荧光物质，配制加入一系列不同量的猝灭剂Q， I0f /If 对cQ进行线性回归得到工作曲线. (Q cQ)

17、当cQ（猝灭剂的总浓度） cM（荧光物质总浓度）时，上式成立。 24 I0f -猝灭剂加入后试剂 的荧光强度； If -猝灭剂加入前试剂的 荧光强度； （4）多组分混合物荧光分析法）多组分混合物荧光分析法 a) 混合物中各组分的荧光峰互不干扰，可 在各自波长下测量，和单组分的测定相同； b) 混合物中荧光峰相互干 扰，激发光谱显著不同， 可以选择不同的激发光进 行测定； 25 c) 同一激发波长荧光光谱互相干扰，利用荧光强度的加和性，建立 联立方程且求解： If 435/385 , If 480/385-混合液在435和480nm出的荧光强度（测定）； K -各纯物质的相对摩尔荧光强度（测定）

18、； CT CP -硫胺素和吡啶硫胺素的浓度（求出）。 利用工作站的软件 PPTTf PPTTf cKcKI cKcKI 480480 385480 435435 385435 / / 26 （5）荧光分析注意事项）荧光分析注意事项 荧光分析是微痕量分析技术，对溶液、工作条件和环境特别敏感： 防止荧光污染 干扰：器皿、溶剂、洗衣粉、洗液、手上的油脂、细菌等 解决：用蒸馏水洗净后再使用，溶液新鲜配制并除氧 防止散射光的干扰 干扰：丁铎尔散射、瑞利散射和拉曼散射 解决：选择合适的测定波长或滤光片 27 上海上海CRT 970 HITACHI（日立）（日立）F-4500 美国美国PE公司公司 LS50

19、B 天津天津WGY-10 7.2.6 荧光分光光度计荧光分光光度计 28 1 荧光分析仪主要部件荧光分析仪主要部件 由光源、单色器、样品池、检测 器和记录装置五个部分组成。 （1）光源）光源： 常见的有氙灯和高压汞灯 （2）单色器）单色器：滤光片和光栅 应用最多的是光栅单色器。一块为激发单色器，用于选择激发光的波长， 另一块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。 荧光的测量通常在与激发光垂直的方向上进行（消除透射光和散射光对 荧光测量的影响）。 29 （3）样品池）样品池：四面透光的的方形石英池 （4）检测器）检测器：光电倍增管和电荷偶合元件检测器 2 仪器灵敏度仪器灵敏度Sa Sa= f f：

20、量子产率， ：摩尔吸光系数 实际测定0.05M H2SO4介质中硫酸奎宁的最低浓度为Sa指标， 其值在1.0 10-101.0 10-12 g/mL 水的拉曼峰高（S）和仪器的噪声值（N）的比值S/N为指标，其值 在20200之间。 30 荧光分析法的特点： 1.灵敏度高灵敏度高 荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高24个数量 级，检测限在0.10.001gmL1之间； 选择性好选择性好 荧光分析法的光谱特征性强，而且有激发光谱和发 射光谱。如果某几种物质的激发光谱相似，就可以从它们发射 光谱的差异进行鉴别和分析；相反如果发射光谱相似，可以从 它们激发光谱的差异进行鉴别和分析； 1.荧光法提供比较

21、多的物理参数荧光法提供比较多的物理参数 激发光谱、发射光谱和三维光 谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些 参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象的分 子的信息； 荧光分析法的缺点： 应用还不够广泛，这是因为本身能发射荧光的物质相对较少。 此外，荧光分析的灵敏度虽高，测定时对环境因素较为敏感， 干扰因素较多。 31 7.2.7 分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用 (1)(1) 无机化合物的分析无机化合物的分析 待测元素与与有机试剂生成具有荧光特性的配合物，约70多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土 采用直接荧光分析法测定； 氟、硫、铁、银、钴、镍 采用荧光

22、猝灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇、过氧化氢 采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲 采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀 采用固体荧光法测定 32 (2) (2) 有机化合物的有机化合物的荧光荧光分析分析 33 (3) (3) 溶液中单分子行为的研究溶液中单分子行为的研究 分子荧光法利用激光诱导产生超高灵敏度（激光诱导荧光），可以用来 观测溶液中某些物质的单分子的行为； 目前，利用激光诱导荧光技术，已经观察到罗丹明6G分子、荧光素分子 和DNA分子等单分子行为。 (4) (4) 基因研究及检测基因研究及检测 DNA自身荧光效率很低，利用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子 的荧光变化来研究

23、DNA与小分子及药物的作用机理，探讨致病原因及筛选 药物！ 变化变化变化，变化，或或 荧光荧光荧光复合物，可发荧光复合物，可发 荧光荧光均不发均不发和和 f IMEBDNAMEBDNAMEBDNA hvEBDNAEBDNA hvMDNADNAMDNAMDNA moleculesmallM * * )( )( 34 荧光分析法新技术简介荧光分析法新技术简介 常规的荧光分析法是分别固定荧光ex和em下，扫描荧光发射光谱和激发光谱。 1同步荧光法同步荧光法 是同时扫描激发光和发射光波长下绘制的光谱，由测定的荧光强度信号与对应 的激发波长（或发射波长）构成光谱图。 通常把在扫描过程中使激发波长（ex）

24、和发射波长（ em）保持固定的波长间 隔（即ex em 常数），这种方法称为固定波长同步荧光测定法，是最早提 出的同步扫描技术。 优点： 光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、 减少散射光影响、提高选择性等 35 2. 导数荧光测定法导数荧光测定法 导数荧光测定法的基本原理与分光光度法类似。导数技术引入荧光分析，解决 了荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题，可以提高荧光分析选择性。 7. 三维荧光光谱测定法三维荧光光谱测定法 描述荧光强度（If）同时随激发波长（ex ）和发射波长（em）变化的关系图 谱，称为三维荧光光谱。 表示方法：一 等角三维投影图 坐标轴分别表示发射波长、激发波长和荧光强度 二

25、 等高线光谱图 平面上的点表示由两波长所决定的样品的荧光强度 36 7.3 分子磷光分析法分子磷光分析法 （1） 磷光的产生磷光的产生 分子从亚稳态T1的最低振 动能级跃迁返回S0态发出的光 （2） 磷光分析磷光分析 低温磷光分析：磷光在室温下易猝灭，将试样溶于有机溶剂 中，在液氮（77K，273 C）中形成刚性玻璃状物质，再测 量磷光。 v 低温可减少分子间碰撞，防止磷光猝灭； v 溶剂易于提纯和制备，能溶解被分析物质 v 77K时溶剂能形成刚性状玻璃体 37 （3） 磷光分析仪磷光分析仪 磷光分析仪器与荧光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有 一些特殊的配件，在比较好的荧光分析仪器上都

26、配有磷光分析的配件， 因此两种方法可以用同一仪器。 磷光分析仪器与磷光分析仪器的主要区别有两点。 I. 样品池需配有冷却装置样品池需配有冷却装置 对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光 分析法，即试样溶液需要低温冷冻。 通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管 （液池）中，然后将液池插入盛有液氮的 石英杜瓦瓶内，如图所示. 38 II. 磷光镜磷光镜 有些物质会同时发射荧光和磷光，因此在测定磷光时， 必须把荧光分离去。可利用磷光寿命比荧光长的特点，在激 发单色器和液池之间装一个磷光镜。 39 转动的两斩波片：转动的两斩波片： 同相时同相时-测定的是荧光和磷光的总强度；测定的是荧光和磷光的总强度；

27、异相时异相时-测定的是磷光强度（因荧光寿命短）。测定的是磷光强度（因荧光寿命短）。 斩波片斩波片 （4） 磷光分析法的应用磷光分析法的应用 磷光分析法主要用于有机化合物的测定，如稠环芳烃和氨基甲 酸酯类农药、可待因等许多生物碱和萘乙酸等植物生长激素。 此外磷光分析技术也已应用于生物活性物质的测定，如色氨酸、 酪氨酸和研究蛋白质的结构。 40 在化学反应过程中，某些化合物接受化学反应能后被激发，从激发 态跃迁回基态时产生的光辐射称为化学发光(chemiluminescence, CL)。 A + B = C * + D C * C + h 7.4 7.4 化学发光分析化学发光分析 （1）化学反应

28、提供足够的化学能被发光物质吸收形成电子激发态， 多是有H2O2、O3等参加的高能氧化反应； （2）发光持续时间较长，反应持续进行； 存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，有酶参与的化学发光反应 称生物发光(bioluminescence)。 41 化学发光效率化学发光效率CL ，又称为化学发光的总量子产率，它决定于生成激发态 分子的产率Cex和发光效率em ，CL 通常较低，一般不超过1 7.4.1 化学发光效率与定量关系式化学发光效率与定量关系式 参加反应分子数参加反应分子数 发射光子的分子数发射光子的分子数 激发态分子数激发态分子数 发射光子的分子数发射光子的分子数 参加反应分子数参加反

29、应分子数 激发态分子数激发态分子数 mCexCLe cdt t c dttI kc t c tI CL t t CL t t CL CLCLCL 2 1 2 1d d 1 d d st 反反应应 化学发光的相对强度Icl(t)与化学发光反应 的速率关系： 42 7.4.2 化学发光分析类型化学发光分析类型 （1 1） 液相化学发光液相化学发光 鲁米诺(Luminol)体系：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）也称冷光剂，在碱 性介质中与H2O2等氧化剂反应，可产生最大发射波长为425 nm的光， 可测痕量的H2O2 、Cu2、Mn2、Co3+、V5+、Fe3+、Cr3+等 金属离子。 化学发光反应效率CL：1 43 光泽精(lucigenin)体系： 光泽精（N, N-二甲基-9, 9-联吖啶二硝酸盐)，在碱