第六章--荧光分光光度法

1、 l基本要求： 了解荧光光谱法的基本原理和应用 特点。了解荧光分光光度计的组成以及 特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。 了解影响荧光强度的因素。 第一节第一节 概论概论 回顾： 四大类 电化学分析法 光学分析法 色谱分析法 其它分析方法 原子光谱法 分子光谱法 X射线光谱法 核磁波谱法 紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法 红外吸收光谱法 拉曼光谱法 1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。 二、特点：二、特点： 灵敏度高，比吸收光谱法高10104倍。ppb 选择性比吸收光谱法好。 一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基

2、态跃到激发态，然 后再回到基态 释放能量以热能的形式。以光辐 射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这 种现象称为光致发光。 荧 光 磷 光 无辐射跃迁 激发态 亚稳态（三重态） 基态 最常见的光致发光：荧光和磷光。 两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9 10-6秒，磷光寿命10-310秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。 激发光谱激发光谱 固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F) 所作的光谱曲线。 300350400 (nm) F 【例】硫

3、酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。 发射光谱发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F 所作的光谱曲线。 300350400 (nm) F 【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。 分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。 能产生荧光的分子具有的结构特点： 共轭双键 刚性平面 多环结构 【例】 芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。 C H2 ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度 F=2.303I0bc 公式成立前提条件：bc=A0.05 即：当试样浓度较低时（c0.05/b），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞

4、机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。） 一、基本结构示意图一、基本结构示意图 特点：1 光源方向与检测方向成直角； 2 二个单色器。 显示器 检测器 荧光单色器 样品池 激发光单色器光源 1光源光源 高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度 计光源大得多。 2激发光单色器激发光单色器 作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。 3样品池样品池 须用石英材料制成。 4荧光单色器荧光单色器 将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧 光通过。 出射狭缝宽度可调。 5检测器检测器 光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向

5、与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的 干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。 一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直线法。作CF直线。 F C 配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5 测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 建立工作直线（ F C） 作图法 回归法 测量待测样品，得F样 从工作直线上找到待测成分的浓度C样 由回归方程计算出C样 1激发光照射激发光照射 有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。 2温度温度 温度，荧光效率下降

6、，F。（因为，温度，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。） 4溶剂溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。 苯胺 pH712时，发兰色荧光。 pH2或PH13时，无荧光。 【例】 所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。 3pH值值 pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。 l灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt 级（10-12）。 l选择性好，与能产生荧光的物质少有关。 一、概念 l（荧光）激发光谱 l（荧光）发射光谱 二、问答题 l试述分子荧光产生的过程。 l试述分子荧光强度与浓度的关系式，并 说明公式成立的前提条件及原因。 l分别说明荧光分光光度计两个单色器的 作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 l为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？ 荧