真菌毒素的检测

1、2021/2/61 第六章第六章 真菌毒素的检测真菌毒素的检测 主要内容主要内容 1.概述概述 2.真菌毒素分类真菌毒素分类 3.真菌毒素检测基本步骤真菌毒素检测基本步骤 2021/2/62 1.概述 真菌毒素真菌毒素-由真菌生产的有毒代谢产物。具由真菌生产的有毒代谢产物。具 有毒性、致癌性、致突变型和致畸性等。有毒性、致癌性、致突变型和致畸性等。 “毒蘑菇、迷神麦、醉谷病毒蘑菇、迷神麦、醉谷病” 真菌毒素的危害真菌毒素的危害: （1）引起粮食作物的病害和产品腐败变质）引起粮食作物的病害和产品腐败变质; （2）对人类和动物健康产生威胁。）对人类和动物健康产生威胁。 2021/2/63 2.真菌

2、毒素分类真菌毒素分类 按产生菌可分为按产生菌可分为:曲霉毒素类、青霉毒素类、 镰刀菌毒素类等。水活度（Aw对真菌生长 和产毒影响较大。 真菌毒素毒性真菌毒素毒性: （1）致）致DNA损伤损伤,有的致癌有的致癌; （2）细胞毒性）细胞毒性,有的破坏质膜和细胞酶的有的破坏质膜和细胞酶的 作用作用 常见的真菌性食物中毒常见的真菌性食物中毒:黄曲霉毒素中毒、 黄变米或灰变米中毒,赤霉沼渣粉中毒等。 2021/2/64 3.真菌毒素检测基本步骤真菌毒素检测基本步骤 1.采样和样品的准备采样和样品的准备 （1）采样的地点）采样的地点 根据分析目的的不同确定采样地点根据分析目的的不同确定采样地点,如如:农田

3、、仓农田、仓 库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。 （2）采样方法）采样方法 1）静态样品的采集）静态样品的采集 静态样品静态样品:麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均 属静态样品。属静态样品。 采样工具采样工具:顶端尖锐的长柄采样钎子。顶端尖锐的长柄采样钎子。 采样数量采样数量:小批量时采小批量时采1/4;大批量时为整批麻袋数大批量时为整批麻袋数 2021/2/65 2）动态样品的采集）动态样品的采集 用商品化的十字交叉切分自动采样器用商品化的十字交叉切分自动采样器 （3）采样量）采样量 采大样采大样,按四分法对角连续多

4、次分样缩减至按四分法对角连续多次分样缩减至12kg,最后取代表样最后取代表样 全部粉碎。全部粉碎。 美国农业部美国农业部USDA的方法的方法:成批样每批取成批样每批取3份大样份大样,每份每份22kg。 实验室分析用的样品为实验室分析用的样品为15kg。 2021/2/66 2.提取提取 1.提取溶剂提取溶剂 溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解 度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。 选用选用:毒性小、极性大、价格低廉的溶

5、剂系统毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统 常用溶剂常用溶剂:甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种 不同配比的混合物。不同配比的混合物。 2.提取温度提取温度 温度影响毒素的回收率温度影响毒素的回收率,适当升高温度可以增加毒素的回收率。适当升高温度可以增加毒素的回收率。 3.食品基质食品基质 固体食品固体食品:选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。 液体食品液体食品:液液分配方法。液液分配方法。 提取酸性真菌毒素时提取酸性真菌毒素时,通常需提高提取溶剂系统中水相的通常需提高提取溶剂系统中水相的pH值

6、值, 使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后,再进行再进行 提取。提取。 2021/2/67 3. 纯化纯化 纯化纯化:在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称为在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称为 纯化。纯化。 常用净化方法常用净化方法: 液固萃取、液液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及液固萃取、液液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及 SFE法等。法等。 使用最广泛的是色谱法。使用最广泛的是色谱法。 色谱法色谱法:薄层色谱法（柱色谱法最常用）薄层色谱法（柱色谱法最常用） 吸附色谱柱常用的吸附剂吸附色谱柱常用的吸附剂:

7、 硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土 分配色谱柱常用的填充剂分配色谱柱常用的填充剂:硅藻土、纤维素。硅藻土、纤维素。 固相提取（广泛采用）固相提取（广泛采用） 免疫亲和柱免疫亲和柱IAC（应用于农产品的新技术）（应用于农产品的新技术） 2021/2/68 4.检测检测 （1）薄层色谱法）薄层色谱法 （2）高效液相色谱法）高效液相色谱法 （3）气相色谱法）气相色谱法 （4）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验 2021/2/69 第二节第二节 主要真菌毒素及其检验主要真菌毒素及其检验 1.黄曲霉毒素黄曲霉毒素 （1）特性 （2）食品中来源 （3）毒性与危害

8、 （4）检测方法）检测方法 2021/2/610 霉菌霉菌 霉菌均由分枝或不分枝的菌丝构成,许多菌丝交织在一起 形成菌丝体,菌丝在光学显微镜下呈管状,210 um 比一 般细菌放线菌细胞大几倍至几十倍,与酵母菌相似,而其菌 丝又分为有隔菌丝和无隔菌丝有隔菌丝和无隔菌丝,再就是根据其功能不同又 分为营养菌丝营养菌丝, ,气生菌丝气生菌丝。 无隔菌丝:菌丝为长管状,单细胞,细胞质内含多个核,其生 长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多,以及细 胞质的增加,如毛霉,根霉,犁头霉。 有隔菌丝:为大多数的。菌丝由横隔膜分隔成成串的多细 胞,每个细胞内含有一个或多个细胞核,有些菌丝外观看起 来像多细胞

9、,但横隔膜上有小孔,使细胞质或细胞核,可自由 流通,每个细胞功能也相同,如青、曲、白地霉。 2021/2/611 营养菌丝营养菌丝（基质菌丝）就是在生长过程中,伸入到培养的 基质中,为真菌提供营养的菌丝。 气生菌丝图气生菌丝图（繁殖菌丝）它主要是伸入到菌周的空气环境 中,它主要作用是产生孢子,产生孢子时的气生菌丝称繁殖 菌丝。 霉菌的繁殖 主要是由繁殖器官产生孢子,繁殖器管是由繁殖菌丝产生 的可以是单细胞,也可是多细胞,有时产生无性孢子,有时产 生有性孢子,如青霉,曲霉,在生长过程中,由于生长条件的改 变,有时产生有性孢子,有时产生无性孢子,但主要还是以无 性孢子为主。 有性孢子有性孢子:子囊

10、孢子,结合孢子,卵孢子,担孢子。 无性孢子无性孢子:分生孢子,关节孢子,芽生孢子,孢子襄孢子,厚膜 孢子。 2021/2/612 霉菌培养特性的鉴定霉菌培养特性的鉴定 青、曲-察氏培养基,镰刀菌、芽枝霉-马铃薯葡 萄糖琼脂进行划线或点种于琼脂上,2528,定 期观察。 生长速度生长速度:培养一定天数（5、10、15天）测大 小,描述常以极慢、慢、中等、快、说明。 菌的颜色菌的颜色:包括子实体,气生菌丝、菌核,埋伏菌 丝及其颜色。 菌落表面构造菌落表面构造: :蔬松,紧密、扁平、隆起,凹陷,或 皱褶,有无同心环,放射沟,并观察菌全部,中心部,中 间部分及边缘部分。 菌落质地菌落质地:外观似毡状、

11、绒毛状、棉絮状、羊毛 状、襄状、粉粒状、明胶状或皮革状。 2021/2/613 1.1.黄曲霉毒素（黄曲霉毒素（aflatoxin,AFT)aflatoxin,AFT)的特性的特性 AFT目前已分离鉴定出目前已分离鉴定出20余种异构体余种异构体,其中最常见的包括其中最常见的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2 。 特性特性: 紫外线下发不同颜色的荧光紫外线下发不同颜色的荧光,蓝色荧光（蓝色荧光（Blue fluorescence）为）为 B族族,黄绿色荧光（黄绿色荧光（yellow-Green fluorescence）为）为G族族;M1和和M2为为 B1、B2的羟化衍生物的羟化衍生物,主要

12、存在于奶（主要存在于奶（milk）及奶制品、肉类）及奶制品、肉类 （meat）中）中,故名故名M族。族。 呋喃环有双键者毒性强呋喃环有双键者毒性强,具有致癌性具有致癌性; 溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂,不溶于水、乙醚、石油醚不溶于水、乙醚、石油醚; 耐热耐热,加热到加热到280才裂解破坏才裂解破坏; 在中性和酸性溶液中稳定在中性和酸性溶液中稳定,在在pH值值9-10的强碱性溶液中迅速分的强碱性溶液中迅速分 解。解。 2021/2/614 2.2.黄曲霉毒素的毒性黄曲霉毒素的毒性 急性毒性急性毒性:剧毒物剧毒物,毒性是氰化钾的毒性是氰化钾的10倍倍,砒霜的砒霜的68倍

13、。倍。 慢性毒性慢性毒性:动物生长迟缓动物生长迟缓,肝脏出现亚急性或慢性损伤。肝脏出现亚急性或慢性损伤。 三致作用三致作用:致癌、致畸、致突变致癌、致畸、致突变 。 3.黄曲霉毒素产生的影响因素黄曲霉毒素产生的影响因素 培养基培养基:花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。 温度和湿度温度和湿度:最适生长温度在最适生长温度在37左右左右,产毒温度略低于最产毒温度略低于最 适生长温度适生长温度,黄曲霉毒素产毒温度黄曲霉毒素产毒温度28-32,相对湿度相对湿度85以以 上。上。 水分水分:产毒的适宜水分活度为产毒的适宜水分活度为0.8-0.9。 pH值值:最适最适pH值

14、为值为3 。 2021/2/615 4.卫生标准卫生标准 1995年年,世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为 15g/kg。 美国规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量美国规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指指 B1+B2+G1+G2的总量的总量)不能超过不能超过15 g/kg 。 我国的标准我国的标准 玉米、花生、花生油、坚果和干果玉米、花生、花生油、坚果和干果(核桃、杏仁核桃、杏仁) 20 g/kg。 大米、其他食用油大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、 茶油、麻

15、油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油) 10 g/kg。 其他粮食其他粮食(麦类、面粉、薯干麦类、面粉、薯干)、发酵食品、发酵食品(酱油、食用醋、豆豉、酱油、食用醋、豆豉、 腐乳制品腐乳制品)、淀粉类制品、淀粉类制品(糕点、饼干、面包、裱花蛋糕糕点、饼干、面包、裱花蛋糕) 5 g/kg。 牛乳及其制品牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、 甜炼乳、奶油甜炼乳、奶油)、黄油、新鲜猪组织、黄油、新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉肝、肾、血、瘦肉) 0.5 g/kg。 2021/2/616 5.黄曲霉毒素的检测方法

16、黄曲霉毒素的检测方法- 薄层层析法薄层层析法 原理原理:将样品经过提取、浓缩、薄层分离后将样品经过提取、浓缩、薄层分离后,在波长在波长365nm紫外光紫外光 下产生蓝紫色（下产生蓝紫色（B1/B2）或黄绿色荧光（）或黄绿色荧光（G1/G2) 提取提取 检测检测 薄层板的制备薄层板的制备 点样点样 展开与观察展开与观察 定量试验定量试验 高效液相色谱法高效液相色谱法 提取提取净化净化衍生衍生测定测定 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法竞争抑制法见教材竞争抑制法见教材P179 2021/2/617 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent as

17、say） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗 原或抗体吸附在固相载体表面原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体使抗原抗体 反应在固相表面进行。反应在固相表面进行。 常用的酶常用的酶:辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）。）。 2021/2/618 ELISA方法的基本原理方法的基本原理 （1）使抗原或抗体结合到固相载体表面）使抗原或抗体结合到固相载体表面,并保持其免疫并保持其免疫 活性。活性。 （2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体,并保持并保持 抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。抗

18、原或抗体的免疫活性和酶的活性。 （3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后,结结 合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或 还原反应还原反应,形成有色物质形成有色物质,其颜色的深浅与标本中的抗其颜色的深浅与标本中的抗 原或抗体原或抗体 的量直接相关。的量直接相关。 2021/2/619 ELISA方法的基本类型方法的基本类型 （一）（一） 双抗体夹心法双抗体夹心法 （二）（二） 间接法间接法 （三）（三） 竞争法竞争法 2021/2/620 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法 洗洗 涤涤 洗洗 涤涤

19、 洗洗 涤涤 待测抗原待测抗原 特异性抗体吸特异性抗体吸 附于固相载体附于固相载体 酶标抗体和底物酶标抗体和底物 2021/2/621 （二）间接法（二）间接法 洗涤洗涤 洗涤洗涤 洗涤洗涤 待测抗体待测抗体 酶标抗抗体酶标抗抗体 2021/2/622 （三）竞争法（三）竞争法 洗涤洗涤 洗涤洗涤 待测抗原待测抗原 酶标抗原酶标抗原 2021/2/623 酶酶联免疫竞争法工作原理联免疫竞争法工作原理 2021/2/624 （1）酶联免疫吸附法）酶联免疫吸附法-竞争抑制法测竞争抑制法测AFB1 试剂试剂:TMB,30%H2O2,牛血清白蛋白,吐温-20 抗体抗体:抗AFB1的特异性单克隆抗体 包

20、被抗原包被抗原:AFB1与载体蛋白的结合物 酶标二抗酶标二抗: 缓冲液缓冲液:磷酸盐缓冲液、终止液1mol/L的硫酸 AFB1标准溶液标准溶液: 2021/2/625 步骤: 1.提取提取:10g样品样品+50ml乙腈乙腈-水水 滤纸过滤滤纸过滤 BSA洗液洗液 稀释稀释 2.测定测定:包被抗原包被酶标微孔板包被抗原包被酶标微孔板 洗液洗去多余抗原洗液洗去多余抗原 加加AFB1标准溶液标准溶液 加稀释抗体（加稀释抗体（37度度1.5h) 洗液洗液 洗洗3次后次后,加酶标二抗（加酶标二抗（ 37度培养度培养2h） 反复洗后加底物溶液反复洗后加底物溶液 加终止液加终止液 （包被包被加样加样-加酶标

21、抗原和待测抗原加酶标抗原和待测抗原-加底物显色加底物显色终止终止 反应反应 （显色原理（显色原理对照管由于只加酶标抗原对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合与固相抗体充分结合,故故 分解底物显色深分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与 固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多,竞争性地抑制竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少。使固相上结合的酶标抗原量减少。 2021/2/626 固定固定OD值值 2021/2/627 微孔板 2021/2

22、/628 微微 孔孔 表表 面面 情情 况况 AFB1包被包被抗体抗体 2021/2/629 . （2）赭曲霉毒素）赭曲霉毒素 毒性毒性:主要对肾产生危害主要对肾产生危害,造成肾肿大造成肾肿大,当浓度超过当浓度超过5mg/kg时时, 对肝脏组织和肠道产生破坏对肝脏组织和肠道产生破坏,引起肠炎等。引起肠炎等。 特性特性:无色结晶化合物无色结晶化合物,易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶 液肿液肿,微溶于水微溶于水,在紫外光照射下在紫外光照射下,呈绿色荧光呈绿色荧光,该化合物稳定该化合物稳定,在在 乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏

23、,但在谷物中随时间但在谷物中随时间 延长而降解。延长而降解。 存在于存在于:粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克 力、中草药、调味料、啤酒等。力、中草药、调味料、啤酒等。 检测方法检测方法:液相色谱法、薄层层析法液相色谱法、薄层层析法 2021/2/630 （3）杂色曲酶毒素）杂色曲酶毒素 毒性毒性:引起肿瘤引起肿瘤 污染污染:小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、 奶酪等。奶酪等。 易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜,微溶于甲醇、微溶于甲醇、 乙醇乙

24、醇,不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下,具有砖红色具有砖红色 荧光。荧光。 检测方法检测方法:薄层法薄层法,紫外分光光度计测定紫外分光光度计测定 2021/2/631 （4）伏马菌素）伏马菌素 自然界中最为普遍自然界中最为普遍,毒性强毒性强,损伤肝肾功能。损伤肝肾功能。 白色粉末白色粉末,易溶于水、甲醇、乙睛等溶剂中易溶于水、甲醇、乙睛等溶剂中, 在甲醇溶液中不稳定在甲醇溶液中不稳定,在乙睛水溶液中非常在乙睛水溶液中非常 稳定。稳定。 检测方法检测方法:高效液相色谱法高效液相色谱法 2021/2/632 . （5）单端孢霉烯族化合物）单端孢霉烯族化合物 头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。 侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。侵害玉米、小麦