流行性脑脊髓膜炎实验室诊断课件

1、流行性脑脊髓膜炎实验室诊断1 流行性脑脊髓膜炎实 验室诊断 天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断2 何谓流行性脑脊髓膜炎？ 流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由 脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides， Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑 膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患 者以儿童为多见，现在成年人发病有增 多趋势。人受Nm 感染后大多数表现为 鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患 者。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断3 正常人群中Nm带菌率可达5 30%。，带菌 者为流脑流行的重要传染源。 细菌经飞沫传播，患者潜伏期1 4天，其发 展经过可分为

2、三期： 1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染， 有时局部有炎症。 2.少数细菌侵入血流，造成单纯 菌血症， 可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等， 并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。 3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊 髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头 痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症 状。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断4 适宜的检测样品 鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出 液、血清及脑脊液等。 其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤 出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为 确诊依据。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断5 样品采集与运送样品采集与运送 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断6 样品采

3、集（一）样品采集（一） 脑脊液：无菌操作，吸出CSF 35mL，立即放 到无菌试管内离心(2000 3000r/min，30min)， 用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10 羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测 Nm特异抗原，亦可将其置于20待测)，5 二氧化碳环境37培养24 72h，每日检查 细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断7 样品采集（二）样品采集（二） 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操 作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内 注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出 血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其 置于一20待

4、测)，同上述条件培养2472h， 每日进行分离培养。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断8 样品采集（三）样品采集（三） 淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或 淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液， 用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖 增菌肉汤管中增菌812h后分离培养或直 接接种10羊血巧克力色琼脂；涂片， 干后革兰染色，直接镜检。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断9 样品采集（四）样品采集（四） 咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两 侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养 基或巧克力双抗平板，也可将咽拭 子放入液体双抗增菌管内，增菌8 12h后分离培养 。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断10 咽拭子接种 流行性脑脊髓膜炎实验

5、室诊断11 咽拭子接种 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断12 不合格咽拭子接种 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断13 不合格咽拭子接种 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断14 样品的处理和运送样品的处理和运送 早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早 期样品，这可以明显提高病原的检出水平。 及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若 无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接 种培养。 保温运送：应尽可能保持样品处于2036之 间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本 除外）。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断15 流脑病原学检查方法流脑病原学检查方法 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断16 生长特性 脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初

6、 次分离时需510%的二氧化碳环 境才能生长，最适生长温度为37 。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断17 菌落特征及菌体形态 菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上， 5%CO2，37 培养24小时后，其菌落 直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、 圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、 无色素。 细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和 肾形，0.80.6大小。常成对排列，邻近 两边扁平凹陷 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断18 菌 落 特 征 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断19 菌 落 特 征 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断20 脑 脊 液 涂 片 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断21 生化特征 分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气

7、。 不分离蔗糖、果糖和乳糖。 过氧化酶和氧化酶阳性 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断22 血清分群鉴定 检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价 、多价、多价抗血清检测，如果 阳性再用分群血清（A群、 B群、C群、 W135群抗血清等）检测。 不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血 清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。 在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血 清分群。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断23 菌种保存菌种保存 短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保 存，可保存7天。 2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。 所有的细菌都可在-70冰箱中冷冻保存。将 脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳 培养箱中

8、35 37 孵育18 20小时，收集细 菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将 菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。 -70 低温冰箱分类保存。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断24 流脑血清学检查方法（一）流脑血清学检查方法（一） 玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm 病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。 Nm诊断血清：国产售品有多价（包含 A、B、C、D群），多价 含1889 （Y）、 1890（H）、1892（29E）， 多价含319（W135）、1916（X）、 1486（I）、1811（K）群及各群单价血 清，共计14种。（括号内为国际编码） 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断25

9、流脑血清学检查方法（二）流脑血清学检查方法（二） 酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用 ELISA间接法测病人急性期和恢复期血 清中抗A群流脑IgG的抗体水平。此方法 也可以应用于健康者血清抗体的测定。 若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈 现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断26 流脑血清学检查方法（三）流脑血清学检查方法（三） 杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC 法)测定病人急性期和恢复期血清中对 Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健 康人群的血清抗体测定。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断27 流脑其它检查方法（一）流脑其它检查方法（一） 胶乳凝集试验应用胶乳凝集

10、实验测定病 人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗 原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑 膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公 司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂 （30l）加上一滴病人的脑脊液，涂匀， 在2分钟内出现明显凝集者为阳性。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断28 流脑其它检查方法（二）流脑其它检查方法（二） PCR检测：应用PCR检查病 人急性期血清或CSF中Nm的 DNA特异片段，对流脑病人 进行早期诊断。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断29 培养基制备培养基制备 巧克力色血液琼脂： 成份：营养琼脂（pH7.6） 100ml 脱纤维血 510ml 制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入 羊血，摇匀

11、。置水浴锅内，维持在 902030min。待培养基冷至50 时才倾注 平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调 查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘 菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断30 卵黄盐水 将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消 毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无 菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清 全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个 烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理 盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈 乳状分装试管，56 加温30 min ，置 37 作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌 用） 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断31 增菌肉汤 成份：新鲜牛肉汤 100ml 葡萄糖 0.5g 配制： 混合上述成份，调pH至 7.47.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高 压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供 增菌用。 流行性脑脊髓膜炎实验室诊断32 诊断试剂诊断试剂 1、诊断血清：中国CDC传