蛋白质的纯化

1、蛋白质的纯化 报告人： 纯化策略 确定研究目标：要获得什么样的蛋白质？ 理化性质 生物活性 重点注意问题 保证活性 减少不必要的纯化步骤 合理组织纯化步骤 捕获 精纯 中间纯化 分离产品， 浓缩，稳定化 去除大量杂质 达到最终纯度： 去除痕量杂质、 结构变异体、 集聚体 步骤 纯度 蛋白质纯化可划分为三大阶段 蛋白质的分离纯化方法 沉淀法 根据分子大小不同：超滤法、透析法（膜分离 法）、 凝胶过滤法（GF）、超速离心法等。 根据分子所带电荷差异：离子交换层析法 (IEX)、电泳法、等电聚焦等。 根据疏水性不同：疏水层析(HIC)、反相色谱 (RPC) 亲和层析(AC) 沉淀法 原理：是使蛋白质

2、胶体颗粒的表面水化膜 或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等点电沉淀法 选择性变性沉淀法 聚合物沉淀法 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）：最大的特点是环境温和，不易造成蛋白 质变性。因此适用于各种蛋白质和酶的分离纯化。缺点是分辨率 底，且后续处理时需要除盐。 有机溶剂沉淀：分辨率高于盐析法，但容易引起目的蛋白失活。 所以多用于生物小分子的分离纯化比如多肽、寡肽。 等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的PI；且沉淀过程中可 能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较 少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的 沉

3、淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不 耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。三氯乙酸是比较常用的 酸变性剂，尤其在分析样品的浓缩而不需考虑活性的条件下用得 多。 有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚 乙二醇作为沉淀剂，常用PEG6000和20000。它条件温和，不 易变性，且沉淀效果强，很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺点 是PEG除去比较困难。 有机溶剂沉淀 原理 F= ，有机试剂有较低的介电常数 e； 水合作用，破坏水化膜。 Q1Q2 er2 操作注意事项 冰浴 缓加 温和搅拌 色谱技术 装柱 缓冲溶

4、液 平衡 上样 收集 洗脱 活性检测 技术捕获 中间纯 化 精纯局限 GF一般很好样品体积和流速受限 IEX很好很好很好 HIC良好很好一般蛋白质对剧烈的洗脱条件敏感 AC很好很好很好 RPC一般很好 由于使用有机试剂，损失了生 物活性 色谱技术应用概况 色谱联用策略 不同色谱技术由于原理不同适用于不同 的起始条件； 应尽可能将不同的色谱技术联合起来， 以减少中间环节： 理想的情况是：前一柱洗脱液条件等同于后 一柱的起始条件。 起始条件 色谱技术 结束条件 小样品体积 样品被稀释 缓冲溶液被交换 低离子强度 PH改变或高离子强度 高离子强度 低离子强度 特定的结合条件 特定的洗脱条件 GF H

5、IC IEX AC 色谱联用流程 IEX HIC GF AC GF RPC IEX HIC GF AC GF (NH4)2SO4 HIC IEX GF HIC GF IEX GF GF （脱盐） AC GF 各种色谱介绍 凝胶过滤层析 也称大小排阻层析，是一种根据分子的大小 和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分 子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相， （在其分离范围内）按分子大小将样品中各 组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后 被洗脱。 应用 脱盐 Sephadex G10、25 缓冲溶液交换 中间纯化 Sephadex G200 精纯 Seph

6、acryl 、Superdex 常用填料 Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的 葡聚糖珠状凝胶。 经典的凝胶介质 Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的 带电集团。 型号最多、应用最广 Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲 基双丙稀酰胺共聚而成。 经济高效 Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的 复合凝胶。 最新，选择性强，分辨率极高 型号分离范围Da粒径建议流速cm/h Sepharose 2B70-40,00060-20010 Sepharose 4B60-20,00045-16511.5 Sepharose 6B10-40,00045-16514

7、 Sepharose CL-2B70-40,00025-7515 Sepharose CL-4B60-20,00025-7526 Sepharose CL-6B10-40,00025-7530 Sepharose 65-5,00020-4030 Sepharose 121-30020-4030 Sepharose FF 610-4,000平均90300 Sepharose FF 460-20,000平均90250 建议流速2039cm/h 建议流速3060cm/h 层析条件的选择 凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越 小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越 高。 流速：孔径较小较结实的填料，耐受的

8、流速要高于孔径大的填料。 上样：上样量；样品浓度PI，但不能高于介质功能基团的PK； 阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求 PHPI，但不能低于介质功能基团的PK； 缓冲溶液： 阴离子交换层析：Tris-HCl 阳离子交换层析：PB 上样：上样量；盐浓度 吸附速度： 洗脱方式：改变离子强度、PH 等梯度洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗 脱需根据出峰情况调整。 离子交换剂的选择 考虑因素： 酸碱强弱：由功能基团决定 稳定性 再生性 经济 离子交换剂的选择 工作PH 2-9 2-12 6-11 2-12 2-12 2-12 常见类型 纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都

9、较低 葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影 响较大； 琼脂糖系：最常用 聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的 苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高 常见问题分析 不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高； 峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲 溶液不纯 分辨率低：梯度太大；流速太高 前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生 峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀 基线随梯度上移：盐浓度临近CMC 疏水层析 蛋白质表面电荷疏水区域分布示意图 “盐促吸附层析” 在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上 的疏水配基产生吸附作用。 特点：它分离效率高，上样量大，特别 适合分离盐析沉淀的样品。 填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝 胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶 等。 反相色谱 原理：是指固定相的极性低于流动相的 极性，在这种层析过程中，极性大的分 子比极性小的分子迁移速度快而先被洗 脱下来。 一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质 容易变性失活； 常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定 的多肽和低分子量蛋白质的分离。 疏水层析VS反相色谱 同：分离介质（固定相） 吸附原理 异：作用强弱 用途 亲和色谱 是利用生物分子间专一的亲和力而进行 分离的一种层析技