细胞实验技术-课堂PPT-第八讲

1、Primary cell culture Methods in Cell Biology Cells that are cultured directly from a subject are known as primary cells. The cells can be removed from the tissue directly and disaggregated by enzymatic or mechanical means before cultivation. Primary culture refers to the stage of the culture after t

2、he cells are isolated from the tissue and proliferated under the appropriate conditions until they occupy all of the available substrate. Methods Trypsin-digestion method, Explant culture Primary culture Material：postnatal day 1 Sprague Dawley rat pups Reagents: PBS , DMEM, Supplemented DMEM/10% fet

3、al bovine serum and 100 units/ml penicillin/streptomycin , Trypsin, 75% ethanol Materials and Reagents Empirical procedure （一）（一）Trypsin-digestion method 1 1、 proper sterile technique ( 75% ethanol ) 2 2、In a “clean bench” with a blowout hood, harvest cerebral cortex or liver and put them in tissue

4、culture dish. 3 3、Rinse it with PBS , Place the sample on the lid of a tissue culture dish and use scissors to mince the cerebral cortex or liver into 1-mm3 pieces and Rinse 3 times with ice-cold PBS, Pour them into a 15-ml polypropylene centrifugal tube. F 4. Remove the PBS by pipetting and immedia

5、tely add 5-6 ml/g tissue of trypsin(0.25%), making sure that the fluid is in contact with all of the tissue in the tube. Cap the tube and transfer it to 37 for 30 min, agitating every 5 to 6 min. Do this with sufficient vigor to break the digested tissue apart. 5. Add DMEM with 20% fetal bovine seru

6、m, serum or medium containing serum to inhibit further trypsin activity. 6. Standing 5-10min, Carefully transfering single cell suspension into a fresh tube . 7. Centrifuge the tube 5 min at 1000 rpm , decant supernatant. 8. Resuspend pellet in PBS, Centrifuge the tube 5 min at 1000 rpm, decant supe

7、rnatant. 9 9、Add DMEM 1-2 ml, count the cells in three or four quadrants of a hemacytometer. 1010、Plate 5105 cells/ml in 5 ml of fresh complete growth in a 25-cm2 tissue culture flask. Place the culture in a humidified 37 C, 5% CO2 incubator （二）（二）Explant culture The tissue is harvested in an asepti

8、c manner, minced, the same as trypsin-digestion method. Four-step, 1-mm3 pieces are placed in a cell culture flask surface, reverse the flask gently, plus growth media in flask. Place the culture in a humidified 37, 5% CO2 incubator. 3-5 hours later, reverse the flask again, gently so as to avoid di

9、sturbing the pieces. use scissors to mince the liver or cerebral cortex into 1-mm3 pieces 1-mm3 pieces are placed in a cell culture flask surface Place the culture in a humidified 37C, 5% CO2 incubator n3-5 hours later, reverse the flask again 步骤（步骤（胰酶消化法胰酶消化法 ） 1、将仔鼠颈椎脱臼致死，置、将仔鼠颈椎脱臼致死，置75%酒精泡酒精泡2-3

10、秒钟秒钟,将仔鼠带入超净台内解剖取肝脏将仔鼠带入超净台内解剖取肝脏( 或大脑皮层等或大脑皮层等) ,置平皿中。置平皿中。 2、用、用PBS液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（ 1mm3 ），再用），再用PBS液洗三次，转移至离心管中。液洗三次，转移至离心管中。 4、视组织块量加入、视组织块量加入5-6倍的倍的0.25%胰酶液，胰酶液，37中消化中消化20-30分钟，每隔分钟，每隔5分钟振荡分钟振荡 一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入、加

11、入3-5ml完全培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。完全培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、静置、静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 7、1000rpm，离心，离心10分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。 8、加入、加入PBS液液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入培养液、加入培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。 10、将细胞调整到、将细胞调整到5105/ml左右，转移至左右，转移至25ml细胞培养瓶中，细

12、胞培养瓶中，37下培养。下培养。 组织块直接培养法组织块直接培养法 自上方法第自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附步后，将组织块转移到培养瓶，贴附 于瓶底面。于瓶底面。 翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触 组织块。入组织块。入37静置静置3-5小时，小时， 轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织 漂起），漂起），37继续培养。继续培养。 Tissue Chop with Crossed Scalpels to 0.5-1.0mm Transfer pieces to flask wi

13、th prewetted pipettes Incubate overnight under Thin film of medium Make up medium to used Volume after 24-48 hrs After about 1 week cells can be seen Migrating radially from the explant Wash by resuspension and settling 2-3X 注意事项注意事项 1、 无菌操作无菌操作 2、细胞吹打、细胞吹打 3、实验安全操作、实验安全操作 原代培养原代培养 （一）胰酶消化法（一）胰酶消化法

14、1、器材：将新生红皮鼠用、器材：将新生红皮鼠用75%酒精消毒，在超净台内处死，解剖取肝脏酒精消毒，在超净台内处死，解剖取肝脏 （或大脑皮层等），置平皿中。（或大脑皮层等），置平皿中。 2、用、用Hanks液（或基培）洗涤液（或基培）洗涤2-3次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3），再用），再用Hanks液洗三次，转移至离心管中。液洗三次，转移至离心管中。 4、视组织块量加入、视组织块量加入5-6倍的倍的0.25%胰酶液，消化胰酶液，消化20-30分钟，每隔分钟，每隔5-6分钟振荡一次，或用吸

15、管吹打一次，使细胞分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞 分离。分离。 5、加入、加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。（培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。（ 悬液过筛网，去除未分散的组织块或静置悬液过筛网，去除未分散的组织块或静置5- 10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。）分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。） 6、 1000rpm，离心，离心5分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。 7、加入完全培养液、加入完全培养液4-6ml（视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。 8、调整细胞密度，转移至培养瓶中，、调整细胞密度，转移至培养瓶中，37下培养。下培养。 （二）组织块直接培养法（二）组织块直接培养法 1.解剖取肝脏（或大脑皮层等）