生物化学实验：胰蛋白酶(trpsin ) 米氏常数的测定

1、胰蛋白酶(trpsin ) 米氏常数的测定 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。 由 牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨 酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性 粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量 24 000，pI 10.8，最适pH值7.88.5左右。在pH为3时最 稳定，pH9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重 金属离子、有机磷化合物、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性 有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、 生丝处理、食品加工等。 酶促反应速度：酶促反应速度：酶促反应体系复杂，影响酶促反应速度 的因素很多，包括底物

2、浓度、酶浓度、产物浓度、pH、 温度、抑制剂和激活剂等影响因素。酶促反应速度通常 用在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的 生成量来表示，用产物浓度对反应时间作图，得到酶促 反应速度曲线。 酶活力的 测定 酶活力的测定一般是通过测定酶 促反应的速度而确定，而酶催化的反应速度可用单 位时间内产物的增加量或底物的减少量来表示。测 定方法主要是根据产物或底物的物理化学特性来决 定具体的测定方法，分光光度法具有操作简便，时 间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的 测定方法。 本实验采用L-BAPA(苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺）作为酶 的底物，分光光度法记录酶促反应生成产物对硝基苯胺引

3、 起的光吸收增加值，通过在410nm连续测定反应过程中产 物光吸收值的变化，做出光吸收时间曲线，从而计算出 酶促反应速度。 底物浓度对酶促反应的影响 在酶浓度，pH，温度等条件不变的 情况下研究底物浓度和反应速度的 关系。如右图所示： 在低底物浓度时, 反应速度与底物 浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有 的酶都与底物结合后，反应速度达 到最大值（Vmax），此时再增加底 物浓度，反应速度不再增加，表现 为零级反应。 1）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物 学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个 反应中底物浓度和反

4、应速度关系的著名公式，称为米氏 方程。 V= Vmax S Km + S K Km m 米氏常数米氏常数 V Vmax max 最大反应速度最大反应速度 2 2） 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmax S max S V Vmaxmax -4-20246810 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1/S(1/mmol.L -1) 1/v 1/Vmax 斜率斜率=Km/Vmax -1/Km 3）米氏常数求法 实验步骤 测活体系：室温条件下测定.调好分光光度计，取两个10mm比色杯,测定波 长为410nM。加入测活缓冲液50mMTris-HCl 10mMCaCl2(pH8.2)，加入不同浓 度的底物，最后加入100ultrpsin使终体积为3mL。空白对照除不加酶，其 它都相同。混匀后，立刻计时，并测定A410nm,每个底物浓度至少记录6个时 间点。即5个A410nm/min, 作图，斜率即为该底物浓度下的反应初速率。 共六个实验组，即六个不同底物浓度，分别测定对应的反应速率