医学交流课件：呼吸疾病基础研究体系建设

1、呼吸疾病基础研究体系建设 p 我国呼吸疾病形势严峻 p 呼吸系统器官结构复杂，细胞种类繁多 （40种） p 呼吸系统是最开放的脏器，影响因素众多，饱受“内忧外患” 临床实践和基础研究结合促进呼吸学科发展 基础研究 创新的研究技术和新的知识理念 临床实践 病症解读和临床数据 指导指导 影响影响 基础研究流程 p肺纤维化 pIPF pTGF-b1-介导的肌成纤维细胞活化 1. 我要研究什么疾病？ 研究疾病的某个方面，也就是某 个表型？ 免疫应答 上皮细胞损伤死亡 肌成纤维细胞活化 肌成纤维细胞的凋亡抵抗 肌成纤维细胞来源 细胞间相互作用及微环境 某个信号通路 2. 我从哪个基因/蛋白入手？ 分子机

2、制研究离不开基因/蛋白 药物也要通过基因/蛋白起作用 pFstl1 pFstl1参与肺发育（PNAS，2011） pTGF-b1 诱导的分泌蛋白 pMicroarray database from Patients with IPF (Pittsburgh, Yale , Duke， 中日医院) 移植研究 挖掘数据库 制备数据库（二代测序、基因 测序、转录组学） 基础研究流程 基础研究流程 3. 确认这个基因/蛋白与疾病表型的相关性？ 临床验证 收集有关标本 实验验证：qRT-PCR，Blot，ELISA，IHC 动物模型 ( in vivo) 疾病模型 遗传模型：KO, KI, Tg, 细胞

3、实验 (in vitro) 选择要研究的表型的细胞模型 Loss-of-function Gain-of-function 基础研究流程 4. 探讨细胞和分子机制？ 相关分子、信号通路和生命过程？ 验证你的基因/蛋白是否与之相关？ 上下游？ 验证上述机制与你的表型相关？ 临床验证 动物模型 ( in vivo) 外植体培养 (ex vivo) 细胞实验 (in vitro) 1. 临床生物标本库和数据库 2. 动物模型 ( in vivo) 3. 外植体培养 (ex vivo) 4. 细胞和分子生物学实验 (in vitro) 基础研究体系 基础研究体系1：临床生物标本库和数据库 n 呼吸疾病

4、研究的基石 n 生物标本库： 肺泡灌洗液： 外周血：血清，血浆，细胞，DNA 肺组织：切片，组织块，RNA 肺细胞：原代成纤维细胞，气道或肺泡上皮细胞，RNA 1. 疾病模型 2. 遗传模型 基础研究体系2：动物模型 小鼠作为模式生物的优势： 基础研究体系2：动物模型 1.1. 自发突变自发突变 2.2. ENUENU诱导的点突变诱导的点突变 3.3. 基因基因knockouts and knock-ins;knockouts and knock-ins; 4.4. 条件性基因敲除条件性基因敲除; ; 5.5. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 6.6. 转基因小鼠转基因小鼠 丰富

5、的遗传资源： p 多种遗传背景：C57BL/6, BALB/c p 多种遗传操作手段： 基础研究体系2：动物模型 呼吸疾病相关基因的功能： What? where? when? KO 小鼠 致病致病 Vs Vs 保护保护 JEM, 2015 JCI, 2010 基础研究体系2：动物模型 呼吸疾病相关基因的功能： cKO 小鼠 Tb bRII CKO: Tbx4rtTA/TetOCre/TRII fx/fx dnTb bRII:Tbx4rtTA/TetOdnTRII 基础研究体系2：动物模型 J Pathol, 2015 组织类型组织类型 疾病阶段疾病阶段 异常重构组织中细胞的命运决定：谱系追踪

6、 Rock JR, PNAS, 2011 基础研究体系2：动物模型 DTA :白喉毒素 异常重构组织中细胞的命运决定：细胞删除 JCI, 2016 Tbx-CreER;Rosa26-DTA 基础研究体系2：动物模型 SPF实验动物中心 笼位设置笼位设置小鼠数量（只小鼠数量（只/笼）笼）饲养条件饲养条件 繁殖笼1，1-2繁殖饲料 维持笼1-5维持饲料 实验笼1-5根据实验要求 特殊处理笼1-5根据实验要求 p 饲养和繁育 p 动物健康监测 1.动物引入设施前的检测 2.设施内动物群体的定期抽检 3.设施内哨兵鼠的定期检测 4.疑似异常小鼠的送检 p 动物隔离和净化 p 小鼠遗传操作 p 胚胎和精

7、子冻存 基础研究体系3：外植体培养 (ex vivo) 肺干细胞的自我更新和分化：3D培养 小鼠 人 ERK/MAPK信号通路与气道形状：胎肺培养 Science,2011 基础研究体系3：外植体培养 (ex vivo) BMP 信号与肺泡结构：肺小切块培养 基础研究体系3：外植体培养 (ex vivo) PNAS,2011 基础研究体系4：细胞、生化和分子生物学 (in vitro) p 原代细胞 p 细胞系 p 基因修饰细胞 p 常规的细胞、 生化和分子 生物学实验体系 p 多学科交叉合作 基础研究体系建设中的几个关键问题 p 临床生物标本库和数据库：课题的来源、进展和结论 p 充分了解和利用丰富的模式动物资源