酶的分子修饰backgrou课件

1、酶的分子修饰backgrou1 酶的分子修饰酶的分子修饰 Enzyme modification 酶的分子修饰backgrou2 1.1.酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念 通过主链的通过主链的“切割切割”、“剪接剪接”和侧链基团的和侧链基团的“化化 学修饰学修饰”,以改变其结构、性质及生物活性等以改变其结构、性质及生物活性等.这种应用化这种应用化 学方法对酶分子施行种种学方法对酶分子施行种种“手术手术”的技术的技术 1.酶的分子修饰概述酶的分子修饰概述 酶的分子修饰backgrou3 或在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团或在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质物质)， 特别是

2、具有生物相容性的特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变物质，进行共价连接，从而改变 酶的结构和性质。酶的结构和性质。 酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念 酶的分子修饰backgrou4 生物体中存在的酶分子修饰生物体中存在的酶分子修饰 v酶原激活酶原激活 v共价修饰共价修饰 酶的分子修饰backgrou5 Proteolytic Zymogen Activation. 酶原激活酶原激活 酶的分子修饰backgrou6 酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去，酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去， 引起酶分子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰引起酶分

3、子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰 调节酶。调节酶。 共价修饰共价修饰 酶的分子修饰backgrou7 酶的共价修饰方式酶的共价修饰方式 磷酸化磷酸化/ /去磷酸化；去磷酸化； 乙酰化乙酰化/ /去乙酰化；去乙酰化； 腺苷酰化腺苷酰化/ /去腺苷酰化；去腺苷酰化； 尿苷酰化尿苷酰化/ /去尿苷酰化；去尿苷酰化； 甲基化甲基化/ /去甲基化；去甲基化； 氧化氧化(SS)/(SS)/还原还原(2SH)(2SH)。 酶的分子修饰backgrou8 磷酸化磷酸化/ /去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式 细菌主要是核苷酰化形式。细菌主要是核苷酰化

4、形式。 酶的分子修饰backgrou9 酶的分子修饰backgrou10 1.2. 酶分子修饰的目的酶分子修饰的目的 基础酶学的研究和疾病治疗基础酶学的研究和疾病治疗 医疗用酶的要求医疗用酶的要求 稳定性高稳定性高 纯度高纯度高 无免疫原性无免疫原性 酶的分子修饰backgrou11 基础酶学研究上基础酶学研究上 (1)探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。 (2)探测酶蛋白的结构变化与运动。探测酶蛋白的结构变化与运动。 (3)测定酶蛋白部分区域的构象状态。测定酶蛋白部分区域的构象状态。 (4)探索酶的作用机理和催化反应历程。探索酶的作用机理和催化反应历程。 (5

5、)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。 (6)研究酶的固定化技术。研究酶的固定化技术。 酶的分子修饰backgrou12 人为地改变天然酶的一些性质人为地改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些优良特性创造天然酶所不具备的某些优良特性 甚至创造出新的活性甚至创造出新的活性,来扩大酶的应用领域。来扩大酶的应用领域。 提高酶活性提高酶活性 ; 增强在不良环境增强在不良环境(非生理条件非生理条件)中的稳定性中的稳定性; 针对异体反应针对异体反应,降低生物识别能力降低生物识别能力, ,降低免疫原性降低免疫原性. Low solubility Poo

6、r stability Oral delivery of proteins impossible because they are destroyed by the digestive system Injected proteins are quickly removed by renal excretion 酶应用研究上的目的酶应用研究上的目的 酶的分子修饰backgrou13 2. 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 2.1. 2.1. 酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰 2.2. 2.2. 大分子结合修饰大分子结合修饰 2.3. 2.3. 小分子修饰小分子修饰 2.4. 2.4. 分子

7、内交联分子内交联 2.5. 2.5. 分子间交联分子间交联 2.6. 2.6. 氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰 2.7. 2.7. 肽链的有限水解肽链的有限水解 2.8. 2.8. 物理修饰物理修饰 酶的分子修饰backgrou14 2.1.酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能 发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称 为离子置换法。为离子置换法。 主要是二价离子的置换修饰主要是二价离子的置换修饰 酶的分子修饰backgrou15 置换修饰过程置换修饰过程

8、 酶液中加入酶液中加入EDTA 透析或超滤透析或超滤 加入金属离子加入金属离子置换修饰酶置换修饰酶 酶的分子修饰backgrou16 等价同荷置换等价同荷置换 置换修饰的要点置换修饰的要点 酶的分子修饰backgrou17 举例举例 蛋白酶（蛋白酶（Zn2 ） ）蛋白酶（蛋白酶（Ca2 ），活力提高 ），活力提高 - -淀粉酶淀粉酶 （杂离子型）（杂离子型）Ca2 型，活力增加， 型，活力增加， 稳定性增加稳定性增加 酶的分子修饰backgrou18 2.2.大分子结合修饰大分子结合修饰 v大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰 v大分子的共价修饰大分子的共价修饰 酶的分子修饰backgrou1

9、9 v大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰 非蛋白质修饰物非蛋白质修饰物 多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 如聚乙二醇、右旋糖苷等如聚乙二醇、右旋糖苷等 酶的分子修饰backgrou20 能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外 部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是 由于保护性大分子由于保护

10、性大分子(如肽和聚胺如肽和聚胺)发挥作用的结果。发挥作用的结果。 酶的分子修饰backgrou21 酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体高就是酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体高就是 这个原因。这个原因。 用抗体来稳定酶。有些抗体能在蛋白质开始伸展的部用抗体来稳定酶。有些抗体能在蛋白质开始伸展的部 位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。 蛋白质类修饰物蛋白质类修饰物 酶的分子修饰backgrou22 -淀粉酶与其抗体的复合物在淀粉酶与其抗体的复合物在70半衰期为半衰期为16h， 而天然酶仅为而天然酶仅为5min。 抗体保护的酶

11、还有抗氧化酶、抗有机溶剂、抗低抗体保护的酶还有抗氧化酶、抗有机溶剂、抗低 pH、抗自溶、抗蛋白酶等作用。、抗自溶、抗蛋白酶等作用。 Taqase 举例举例 酶的分子修饰backgrou23 ANNEALING 37C - 65C EXTENSION 72C 25-35 CYCLES DENATURATION 93C - 95C DENATURATION 93C - 95C 酶的分子修饰backgrou24 优点：优点： 抗体制备简单抗体制备简单 任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简 单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。单、迅速。所以，用抗体稳定

12、酶的方法较普遍。 酶的分子修饰backgrou25 缺点：缺点： 制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最 近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能 的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋 白又生产其抗体的可能性。白又生产其抗体的可能性。 在医学上要解决酶在医学上要解决酶抗体复合物在体内的抗原性。目前抗体复合物在体内的抗原性。目前 采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体 酶的分子修饰backgro

13、u26 v大分子的共价修饰大分子的共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层 酶的分子修饰backgrou27 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)，不仅可以降低或，不仅可以降低或 消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了 酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。 日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶

14、、胰凝乳蛋白酶上所 得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起 作用。作用。 嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链断裂，但用聚嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链断裂，但用聚 乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂 中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。 酶的分子修饰backgrou28 PEG: HO-CH2-CH2-(OCH2CH2)nCH2CH2-OH -OCO-(CH2)2COO-N O O PEG NH2-Prt -OCO-(CH2)2CO

15、-PEG NH-Prt 酶的分子修饰backgrou29 NH+ R2 R1 R1 O CO O CO HOH2C (CHOH)4 CO NH + E 酶的分子修饰backgrou30 PEG binds 2-3 water molecules per repeat unit PEG/water shield can reduce activity of protein, but generally the increased circulation time makes up for this 酶的分子修饰backgrou31 PEGylated microspheres: Li et al

16、. showed significant increases in circulation time by preparing controlled release microparticles using PEG- PLGA block copolymers Block copolymer self-emulsifies and PEG coats both internal and external aqueous interfaces Benefit of improved protein stability within microspheres? 酶的分子修饰backgrou32 B

17、lock copolymer localizes at aqueous/polymer interfaces 酶的分子修饰backgrou33 Unmodified PLGA particles t1/2 = 13.6 min. PEG block copolymer particles t1/2 = 270 min (4.5 hr) Altered biodistribution: high blood availability and reduced spleen/liver uptake No PLGA particles remaining in blood after 12 hrs

18、Harris, J. M. Enz-OH, Ser221 of subtilisin; Enz-NH2, lysine residues on the surface of the enzyme; Ph, phenyl. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3:3538 酶的分子修饰backgrou57 枯草杆菌蛋白酶经预处理枯草杆菌蛋白酶经预处理,冻干形成交联酶晶体冻干形成交联酶晶体,在有机在有机 溶剂和水溶液中的稳定性大大增加溶剂和水溶液中的稳定性大大增加,活力可提高活力可提高13倍倍 利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联利用葡聚糖二乙醛将

19、青霉素酰化酶进行交联,使其在使其在 55下的半衰期提高下的半衰期提高9倍倍,而保持不变而保持不变 酶的分子修饰backgrou58 2.5.分子间交联分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。 例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。 这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低。酶的自溶作用降低。 酶的分子修饰backgrou59 2.6.氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰 化学方法化学方法 难度大，很少有使用难度大，很少有使用 酶的分子

20、修饰backgrou60 基因工程的方法基因工程的方法 随机突变技术（随机突变技术（Methods of random mutagenesis） 1. chemical synthesis 2. error-prone PCR 3. DNA shuffling 酶的分子修饰backgrou61 Mutagenesis:Why Mutate? Native proteins are not well suited for industrial application Native proteins are not optimized for medicinal purposes Increase

21、 the efficiency of enzyme-catalyzed reactions Eliminate the need for cofactor in enzymatic reaction Change substrate binding site to increase specificity Change the thermal tolerance Change the pH stability Increase proteins resistance to proteases (purification) Signal sequences secretion rare codo

22、n changes 酶的分子修饰backgrou62 工程二硫键工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性 酶表面亲水化酶表面亲水化 抗氧化失活抗氧化失活 Asn脱酰胺失活脱酰胺失活 定点突变技术（定点突变技术（site-directed mutagenesis) 酶的分子修饰backgrou63 1990年年Goodson将干扰素的将干扰素的Thr3替换为替换为Cys3，并通过，并通过 PEG修饰，水溶性增加，半衰期延长修饰，水溶性增加，半衰期延长(工程二硫键工程二硫键 ) 噬菌体噬菌体T4溶菌酶溶菌酶Ile3突变为突变为Cys3，使与，使与Cys97形成二硫键，形成二硫键， 催化

23、活性不变，但热稳定性显著提高催化活性不变，但热稳定性显著提高(工程二硫键工程二硫键) xylanase(工程二硫键工程二硫键) used to treat wood pulp in paper production needs to function at high temp Glu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如Ala取代，取代， 稳定性增加稳定性增加(增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性) 酶的分子修饰backgrou64 Three-Dimensional Structure of T4 Lysozyme 酶的分子修饰backgrou65 Ho

24、w many residues can be systematically changed and retain the same fold? or what fraction of the sequence is necessary for folding? nTo assess how many residues are necessary or essential for maintaining the same fold, single and multiple alanines were inserted into three helices in T4 lysozyme. 39-5

25、0; 115-123; and 126- 134. nThis type of approach is opposite to designing a protein from first principles. nWhat are the observations and conclusions? 酶的分子修饰backgrou66 Location of new disulfide bonds in T4 lysozyme Introduction of disulfide bonds must be formed in the context of a structure. Only a

26、limited number of locations in a protein can accept two cysteine residues in an orientation that can accept the S-S bond without generating conformational strain (software now exists which can help in this choice). In principle, the larger the loop the greater the reduction in the entropy of the unf

27、olded state. 酶的分子修饰backgrou67 Lys取代葡萄糖脱氢酶的取代葡萄糖脱氢酶的Ser231，突变体在，突变体在55 的半衰期比天然酶高的半衰期比天然酶高8 倍，活力相当倍，活力相当 (酶表面亲水化酶表面亲水化) 枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶的Cys取代取代Met222催化速度增加催化速度增加2倍；用倍；用Ala、Ser 或或 Leu取代取代Met222，酶可以抵抗高达，酶可以抵抗高达1mol/L H2O2的氧化失活的氧化失活 (抗氧化失活抗氧化失活) 三糖磷酸异构酶的三糖磷酸异构酶的Asn144用用Thr取代，取代，Asn78用用Ile取代，突变酶在取代，突变酶在 1

28、00 的稳定性比天然酶高的稳定性比天然酶高2倍；枯草杆菌倍；枯草杆菌-淀粉酶淀粉酶Asn190用用Ala取代，取代， 在在80 的半衰期增加的半衰期增加6倍倍(Asn脱酰胺失活脱酰胺失活) 酶的分子修饰backgrou68 PCR定点突变定点突变(PCR mutagenesis) Introduces sequence changes into (cloned) DNA fragments; Overlap extension method requires 2 mutagenic primers and 2 others; Amplify a 5 fragment and a 3 fragm

29、ent that overlap and each have the mutation; Use these products in another reaction to produce the full- length mutated DNA. 酶的分子修饰backgrou69 PCR mutagenesis- overlap extension SP6 primer forward mutagenic primer reverse mutagenic primer T7 primer X x x x Two separate 1st PCRs remove primers, denatu

30、re and re-anneal 2nd PCR 酶的分子修饰backgrou70 “If a biochemist wishes to improve on a behaviour that is already optimized by natural selection, mutants are unlikely to yield enzymes with improved performances” S. Benner (1989) Chem.Rev. 89,789-806 酶的分子修饰backgrou71 2.7. 肽链的有限水解与肽链的延伸肽链的有限水解与肽链的延伸 生物体内：酶原

31、激活生物体内：酶原激活 主要是降低免疫原性主要是降低免疫原性 用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，2/3被除去，但活力被除去，但活力 不变不变 烯醇化酶在水解掉烯醇化酶在水解掉150个氨基酸后，活力仍可保持个氨基酸后，活力仍可保持 酶的分子修饰backgrou72 肽链的延伸肽链的延伸 Phusion iProof 酶的分子修饰backgrou73 2.8.物理修饰物理修饰 通过物理方法改变酶的空间构象通过物理方法改变酶的空间构象 羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利 于合成反应于合成反应 纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高 酶的分子修饰backgrou74 酶的分子修饰backgrou75 酶的分子修饰backgrou76 酶的分子修饰backgrou77 补充材料补充材料 Esterification of phenyl-ethanol with lauric acid CH3 H O CCOC11H23 CH3 H OH C+HOCOC11H23 E Isooctane 4