酶的非水相催化(4)课件

1、酶的非水相催化(4)1 第七讲第七讲 酶的非水相催化酶的非水相催化 讲课：阳飞讲课：阳飞 酶的非水相催化(4)2 酶的非水相催化酶的非水相催化 7.17.1、酶催化反应的介质、酶催化反应的介质 7.27.2、有机介质反应体系、有机介质反应体系 7.37.3、有机介质反应体系影响因素、有机介质反应体系影响因素 7.47.4、酶在有机介质中的催化特性、酶在有机介质中的催化特性 Go Go Go Go 7.57.5、有机介质中酶催化反应的条件及其控制、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 Go 7.67.6、酶非水相催化的应用、酶非水相催化的应用 Go 酶的非水相催化(4)3 7.1 7.1 酶催化反

2、应的介质酶催化反应的介质 水是酶促反应最常用的反应介质！水是酶促反应最常用的反应介质！ 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多 有机化合物有机化合物( (底物底物) )在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合、分解水解、消旋化、聚合、分解等副反应的发生。等副反应的发生。 是否存在非水介质能保证酶催化是否存在非水介质能保证酶催化 19841984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（KlibanovKlibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反

3、应的研究，）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究， 成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇酯类、肽类、手性醇等多种有机等多种有机 化合物，明确指出化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。 酶的非水相催化(4)4 酶非水相催化的类型酶非水相催化的类型 o1 1、有机介质中的酶催化、有机介质中的酶催化 o2 2、气相介质中的酶催化、气相介质中的酶催化 o3 3、超临界介质中的酶催化、超临界介质中的酶催化 o4 4、离子液介质中的酶催化、离子液介质中的酶催化 酶的非水相催化

4、(4)5 1 1、有机介质中的酶催化、有机介质中的酶催化 o指酶在指酶在含有一定量水含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。的有机溶剂中进行的催化反应。 o适用对象：底物、产物两者或其中之一为适用对象：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质疏水性物质 o优点：优点： 酶在有机介质中酶分子的构象表现出比水溶液中更具酶在有机介质中酶分子的构象表现出比水溶液中更具“刚性刚性”； 有机介质中酶的稳定性得到显著提高；有机介质中酶的稳定性得到显著提高； 由于有机溶剂的存在，大大降低许多需要水参与的副反应；由于有机溶剂的存在，大大降低许多需要水参与的副反应； 可以省略产物的萃取分离过程，提高收率。可以省略产物

5、的萃取分离过程，提高收率。 立体选择性、手性选择性立体选择性、手性选择性 酸酐水解、氰醇消旋化、酰基转移酸酐水解、氰醇消旋化、酰基转移 酶的非水相催化(4)6 2 2、气相介质中的酶催化、气相介质中的酶催化 o酶在酶在气相介质气相介质中进行的催化反应。中进行的催化反应。 o适用对象：底物是气体或者能够转化为适用对象：底物是气体或者能够转化为气体的物质气体的物质 o由于气体介质的由于气体介质的密度低，扩散容易密度低，扩散容易，因此酶在气相，因此酶在气相 中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不 同特点。同特点。 酶的非水相催化(4)7 3 3、超临

6、界介质中的酶催化、超临界介质中的酶催化 o酶在酶在超临界流体超临界流体中进行的催化反应。中进行的催化反应。 o超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体。超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体。 o超临界流体的超临界流体的物理特性和传质特性通常介于液体和物理特性和传质特性通常介于液体和 气体之间，气体之间，黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度大大低于液体的黏度，接近气体的 黏度，有利于物质的扩散；其扩散系数接近于气体，黏度，有利于物质的扩散；其扩散系数接近于气体， 是通常液体的近百倍，可迅速渗透到物体的内部而是通常液体的近百倍，可迅速渗透到物体的内部而 溶解目标物质，快速达到萃取平衡。溶解目

7、标物质，快速达到萃取平衡。 酶的非水相催化(4)8 4 4、离子液介质中的酶催化、离子液介质中的酶催化 o酶在酶在离子液离子液中进行的催化作用中进行的催化作用 o离子液（离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）是由有机阳离子与有机（无机） 阴离子构成的在室温条件下阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥呈液态的低熔点盐类，挥 发性低、稳定性好发性低、稳定性好。 o酶在离子液中的催化作用酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选具有良好的稳定性和区域选 择性、立体选择性、键选择性择性、立体选择性、键选择性等显著特点。等显著特点。 酶的非水相催化(4)9 7.27

8、.2、有机介质反应体系、有机介质反应体系 1 1、非极性有机溶剂、非极性有机溶剂酶悬浮体系酶悬浮体系 o用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶固体酶悬浮在有机相中，但仍然含悬浮在有机相中，但仍然含 有必需的结合水以保持酶的催化活性有必需的结合水以保持酶的催化活性( (含水量一般小于含水量一般小于2%)2%)； o酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态或者吸附在固体载体表面上酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态或者吸附在固体载体表面上 2 2、与水互溶的有机溶剂、与水互溶的有机溶剂水单相均一体系水单相均一体系 o有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系，酶

9、、底物和产物都能溶解在体系中有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系，酶、底物和产物都能溶解在体系中 3 3、非极性有机溶剂、非极性有机溶剂水两相水两相/ /多相体系多相体系 o由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体系 4 4、胶束体系、胶束体系 ( (微水介质体系微水介质体系) ) 正胶束体系、反胶束体系正胶束体系、反胶束体系 不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水，不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水， 都都 对催化反应有显著的影响。对催化反应有显著的

10、影响。 酶的非水相催化(4)10 胶束体系胶束体系 o胶束胶束也称为也称为正胶束或正胶团正胶束或正胶团，是在大量，是在大量水水溶液中含有少量与水溶液中含有少量与水 不相混溶的不相混溶的有机溶剂有机溶剂，加入，加入表面活性剂表面活性剂后形成的水包油后形成的水包油(0(0W)W) 的微小液滴。表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的微小液滴。表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水 的非极性基团两部分组成的两性分子，既能溶解水溶性物质又的非极性基团两部分组成的两性分子，既能溶解水溶性物质又 能增溶疏水性物质。能增溶疏水性物质。 酶的非水相催化(4)11 o正胶束正胶束是通过表面活性剂的极性端

11、朝外，与水结合，非极是通过表面活性剂的极性端朝外，与水结合，非极 性端朝内，有机溶剂包在液滴内部，形成一个非极性的核性端朝内，有机溶剂包在液滴内部，形成一个非极性的核 心形成，如图心形成，如图(a)(a)所示。正胶束体系中所示。正胶束体系中水相是连续相，有机水相是连续相，有机 相相( (油相油相) )是分散相是分散相。酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶。酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶 液中，疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在胶束的两液中，疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在胶束的两 相界面中进行。相界面中进行。 o反胶束反胶束是由水表面活性剂有机溶剂所组成的低水含量是由水表面活性剂有机溶剂所

12、组成的低水含量 的油包水的油包水(W(WO)O)微乳液。它是一个宏观均匀、微观多相的微乳液。它是一个宏观均匀、微观多相的 热力学稳定体系，该体系是一种两亲介质，既能溶解水溶热力学稳定体系，该体系是一种两亲介质，既能溶解水溶 性物质又能增溶疏水性物质，其中性物质又能增溶疏水性物质，其中有机相有机相( (简称油相简称油相) )是连是连 续相，水相是分散相续相，水相是分散相，油相与水相之间通过表面活性剂单，油相与水相之间通过表面活性剂单 分子层隔开形成球状的反胶束微粒，如图分子层隔开形成球状的反胶束微粒，如图 (b)(b)所示。所示。 酶的非水相催化(4)12 反胶束体系反胶束体系 o溶剂：溶剂：非

13、极性有机溶剂非极性有机溶剂，常用的是六碳以上的直链及支链烷，常用的是六碳以上的直链及支链烷 烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二乙醚），烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二乙醚）， 其中其中正辛烷正辛烷或或异辛烷异辛烷用得最多；用得最多； o表面活性剂：阳离子型表面活性剂：阳离子型(CTAB(CTAB：溴化十六烷基三甲基胺：溴化十六烷基三甲基胺) )、阴、阴 离子型离子型(AOT(AOT：2-2-乙基己基乙基己基- -琥珀酸酯磺酸钠琥珀酸酯磺酸钠) )、非离子型（、非离子型（TweenTween 系列）。系列）。 o反胶束微粒的大小：取决于反胶束的含水量反胶束微粒的大小：取

14、决于反胶束的含水量(Wo)(Wo)。WoWo的定义的定义 为为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂 中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。反胶束体系中。反胶束体系中 的水通常可分为的水通常可分为结合水和自由水结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部。结合水是指位于反胶束内部 形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。 研究表明不同的酶有不同的最适研究表明不同的酶有不同的最适WoWo值值，该值取决于表面活性剂，该值取决于

15、表面活性剂 和酶的性质，即反胶束的内核体积与酶分子体积要相适应。酶和酶的性质，即反胶束的内核体积与酶分子体积要相适应。酶 活力与活力与W W。的关系一般符合钟形曲线。的关系一般符合钟形曲线。 酶的非水相催化(4)13 反胶束体系的优点：反胶束体系的优点： o具有组成灵活、热力学稳定（漆酶在反胶束体系中的具有组成灵活、热力学稳定（漆酶在反胶束体系中的 活性约为水中的活性约为水中的6060倍；过氧化物酶约为水中的倍；过氧化物酶约为水中的100100倍，倍， 而酸性磷酸酶约为水中的而酸性磷酸酶约为水中的200200倍）；倍）； o界面积大、可通过相调节来实现产物回收，既能为反界面积大、可通过相调节来

16、实现产物回收，既能为反 应物和产物提供有机相，又能为酶分子维持其活性提应物和产物提供有机相，又能为酶分子维持其活性提 供稳定的微环境供稳定的微环境. . 酶的非水相催化(4)14 反胶束体系的应用反胶束体系的应用 近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是肽的合成肽的合成 和和脂肪酶脂肪酶的催化反应：的催化反应： oXing等研究了等研究了AOT正辛烷正辛烷的反胶束体系中，的反胶束体系中，-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 催化催化合成肽衍生物合成肽衍生物的反应得到的反应得到5688的产率，而且还对反的产率，而且还对反 应体系的应体系的Wo值、反应时间和酶浓度

17、等条件进行了讨论；值、反应时间和酶浓度等条件进行了讨论； oChen等在反胶束体系中用不同的等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽蛋白酶合成了二肽； oTsai等研究了等研究了AOT异辛烷磷酸盐缓冲液异辛烷磷酸盐缓冲液中，中，脂肪酶催化脂肪酶催化油油 脂水解反应时，表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响；脂水解反应时，表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响； o李干佐等研究了李干佐等研究了AOT异辛烷水体系异辛烷水体系中解中解脂假丝酵母脂肪酶脂假丝酵母脂肪酶 催化催化庚酸和庚醇的酯化反应动力学；庚酸和庚醇的酯化反应动力学； oRees等研究了等研究了阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂CTAB的反胶

18、束体系中的反胶束体系中有色黏性有色黏性 细菌脂肪酶催化细菌脂肪酶催化癸酸辛酯的合成；癸酸辛酯的合成； o马成松等还研究了马成松等还研究了辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶在在AOT水异辛烷水异辛烷中多底中多底 物酶促反应等。物酶促反应等。 酶的非水相催化(4)15 反胶束酶体系的制备方法反胶束酶体系的制备方法 o(1)注入法：注入法： 将含有酶的水相将含有酶的水相注入注入到含有表面活性剂的有机相中（到含有表面活性剂的有机相中（最常用最常用） o(2)液体萃取法：液体萃取法： 将含酶的水相与含表面活性剂的有机相将含酶的水相与含表面活性剂的有机相直接接触直接接触（过程较慢过程较慢） o(3)固体萃取法：

19、固体萃取法： 将酶固体粉末与含水反胶束有机溶剂将酶固体粉末与含水反胶束有机溶剂一起搅拌一起搅拌（时间长，易变性时间长，易变性） 酶的非水相催化(4)16 酶在反胶束体系中的活力酶在反胶束体系中的活力 o酶在反胶束体系中的活力主要由三方面的因素决定：酶在反胶束体系中的活力主要由三方面的因素决定： 核心水团的大小核心水团的大小、表面活性剂的种类表面活性剂的种类及及反胶束微粒的浓度反胶束微粒的浓度。 o由于反胶束模型和组成对酶活性有影响，调节反胶束由于反胶束模型和组成对酶活性有影响，调节反胶束 的特性可使酶更适合于特定的反应，提高反应速度。的特性可使酶更适合于特定的反应，提高反应速度。 研究者认为反

20、胶束相当于一个微反应器研究者认为反胶束相当于一个微反应器，它对，它对水溶性水溶性 底物有浓缩作用底物有浓缩作用，使底物在核心水团中的实际浓度远，使底物在核心水团中的实际浓度远 高于在水溶液中的浓度，从而产生高于在水溶液中的浓度，从而产生“超活性超活性”。 o近几年，有人提出是由于近几年，有人提出是由于表面活性剂膜引起了酶分子表面活性剂膜引起了酶分子 构象刚性的增加及胶束中结合水的特殊性质构象刚性的增加及胶束中结合水的特殊性质共同影响共同影响 造成的。造成的。 酶的非水相催化(4)17 反应体系对酶酯化反应的影响反应体系对酶酯化反应的影响 反应体系含反应体系含1-三甲基硅三甲基硅-1-乙醇乙醇1

21、0 mM，戊酸，戊酸10 mM，内标正十五烷，内标正十五烷， 脂肪酶脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应条件下振荡反应 1：水饱和正已烷：水饱和正已烷10 ml，2 pH7.2缓冲液缓冲液5 ml+正已烷正已烷10 ml 酶的非水相催化(4)18 7.37.3、有机介质反应体系影响因素、有机介质反应体系影响因素 o1 1、反应体系中水对酶催化反应的影响、反应体系中水对酶催化反应的影响 o2 2、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响 酶的非水相催化(4)19 1 1、反应体系中水对酶催化反应的影响、反应体系中水对酶催化反应的影响 酶都溶于水，

22、只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才 能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是水是 不可缺少的成分不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构空间构 象象、酶的、酶的催化活性催化活性、酶的、酶的稳定性稳定性、酶的、酶的催化反应速度催化反应速度等都有密等都有密 切关系，水还与酶催化作用的切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度底物和反应产物的溶解度有关。有关。 酶的非水相催化(4)20 总体来讲，水在酶催化反应中发挥着总体来讲，水

23、在酶催化反应中发挥着双重作用双重作用： o一方面，水分子直接或间接地通过一方面，水分子直接或间接地通过氢键、疏水键及范德华氢键、疏水键及范德华 力等非共价键相互作用力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象。来维持酶的催化活性所必需的构象。 oGupta认为，无水条件下酶分子的带电基团和极性基团之认为，无水条件下酶分子的带电基团和极性基团之 间相互作用，形成一种间相互作用，形成一种非活性的非活性的“封闭封闭”结构结构，水的加入水的加入 可削弱这种相互作用可削弱这种相互作用，使非活性的，使非活性的“封闭封闭”结构变得结构变得“疏疏 松松”，酶分子的，酶分子的柔韧性增加柔韧性增加，并通过，

24、并通过非共价作用力非共价作用力来维持来维持 酶的催化活性构象，与酶分子紧密结合的一层左右的水分酶的催化活性构象，与酶分子紧密结合的一层左右的水分 子，对酶的催化活性是至关重要的（子，对酶的催化活性是至关重要的（必需水必需水）。）。 o不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是 不同的不同的。 例如：例如：糜蛋白酶糜蛋白酶在在辛烷辛烷中催化反应时需中催化反应时需5050个水分子，而个水分子，而多多 酚氧化酶、酪氨酸酶酚氧化酶、酪氨酸酶等则需要几百个水分子。等则需要几百个水分子。 酶的非水相催化(4)21 o另一方面，另一方面，水是导致酶的

25、热失活的重要因素水是导致酶的热失活的重要因素，有水存，有水存 在时，随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活：在时，随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活： 形成不规则结构；形成不规则结构； 二硫键受到破坏；二硫键受到破坏； 天冬酰胺和谷氨酰胺水解转化为相应的天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺水解转化为相应的天冬氨酸和谷氨酸； 天冬氨酸肽键发生水解。天冬氨酸肽键发生水解。 o因此，在有机介质的酶催化体系中，因此，在有机介质的酶催化体系中，存在着最佳含水存在着最佳含水 量量，该最佳含水量不仅取决于酶的种类，也与所选用，该最佳含水量不仅取决于酶的种类，也与所选用 的有机溶剂有关。的有机溶剂有关

26、。 酶的非水相催化(4)22 有机溶剂中酶活性与含水量的关系有机溶剂中酶活性与含水量的关系 o大量实验表明，酶的催化活性与加水量的关系大量实验表明，酶的催化活性与加水量的关系 总是呈曲线形，而且大都为总是呈曲线形，而且大都为钟罩形钟罩形。 酶的非水相催化(4)23 水活度水活度(Aw) o在有机介质中含有的水主要有两类，一类是与酶分子在有机介质中含有的水主要有两类，一类是与酶分子 紧密结合的紧密结合的结合水结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的，另一类是溶解在有机溶剂中的游游 离水离水。 o研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结 合水量的增加而

27、提高。在结合水量不变的条件下，体合水量的增加而提高。在结合水量不变的条件下，体 系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。因此可系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。因此可 以认为，在有机介质体系中，以认为，在有机介质体系中，结合水是影响酶催化活结合水是影响酶催化活 性的关键因素性的关键因素，而水含量却受到酶分子以外的各种因，而水含量却受到酶分子以外的各种因 素影响。素影响。 o为了更为确切地反映水与酶催化活性的关系，为了更为确切地反映水与酶催化活性的关系，Halling 提出提出用水活度用水活度(Aw)来描述水对酶催化特性的影响。来描述水对酶催化特性的影响。 酶的非水相催化(4)24 oAw

28、定义定义：在一定的温度和压力下，反应体系的水蒸气压和纯水：在一定的温度和压力下，反应体系的水蒸气压和纯水 的蒸气压之比，直接反应了酶分子上水的多少，与其他因素无的蒸气压之比，直接反应了酶分子上水的多少，与其他因素无 关。即：关。即：Aw=P/Po；式中，；式中，P表示在一定温度和压力下反应体系表示在一定温度和压力下反应体系 中水的蒸气压；中水的蒸气压；Po表示在相同条件下纯水的蒸气压。表示在相同条件下纯水的蒸气压。 o当体系达到平衡态时，体系中各部分的当体系达到平衡态时，体系中各部分的Aw值相等。值相等。 o由于有机介质酶促反应体系中水的重要作用，可以通过体系中由于有机介质酶促反应体系中水的重

29、要作用，可以通过体系中 含水量的不同，使反应向着所期望的方向发展。一方面可以通含水量的不同，使反应向着所期望的方向发展。一方面可以通 过过调节含水量调节含水量，影响酶的水化程度及物理状态，使酶根据需要，影响酶的水化程度及物理状态，使酶根据需要 表现出不同的催化活性；另外还可以通过表现出不同的催化活性；另外还可以通过改变体系中的改变体系中的AwAw而改而改 变反应的平衡点。变反应的平衡点。 酶的非水相催化(4)25 体系中水含量的有效控制的方法：体系中水含量的有效控制的方法： o(1)(1)在反应的初期向反应体系中添加适量的水在反应的初期向反应体系中添加适量的水（最早和最普遍采最早和最普遍采 用

30、用），对反应过程中没有水产生的体系非常适用，但是对于），对反应过程中没有水产生的体系非常适用，但是对于脂脂 肪酶和蛋白水解酶肪酶和蛋白水解酶等，由于它们在非水介质中分别催化酯合成等，由于它们在非水介质中分别催化酯合成 和肽合成反应，副产物水随着反应的进行不断产生并且进入反和肽合成反应，副产物水随着反应的进行不断产生并且进入反 应体系，该法不适用；应体系，该法不适用； o(2)(2)将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液形成的气相环境中进行将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液形成的气相环境中进行 预平衡预平衡：不同的饱和盐溶液对应不同的蒸气压，将酶与盐的饱：不同的饱和盐溶液对应不同的蒸气压，将酶与盐的饱

31、和溶液平衡，同时将含有底物的溶剂平衡至相同的和溶液平衡，同时将含有底物的溶剂平衡至相同的Aw，然后混，然后混 合进行反应。合进行反应。 酶的非水相催化(4)26 o(3)(3)敞口自由挥发法：敞口自由挥发法： 由于反应体系中有机溶剂更容易挥发，不宜采用采用由于反应体系中有机溶剂更容易挥发，不宜采用采用 o(4)(4)向反应体系中通惰性气体或干燥空气来带走反应过程中向反应体系中通惰性气体或干燥空气来带走反应过程中 产生的多余的水：产生的多余的水： 一方面一方面浪费能源、成本高浪费能源、成本高，另一方面，另一方面不容易准确控制体系的水不容易准确控制体系的水 含量含量，操作过程并不要求除掉体系中所有

32、的水，而是控制体系，操作过程并不要求除掉体系中所有的水，而是控制体系 水含量稳定在一个非常狭小的范围内，而且体系中的反应介质水含量稳定在一个非常狭小的范围内，而且体系中的反应介质 和底物也可能被带走，不容易被广泛接受；和底物也可能被带走，不容易被广泛接受； o(5)(5)渗透蒸发法：渗透蒸发法： 即通过均一的非多孔膜来实现体系中水的转移，可以连续除去即通过均一的非多孔膜来实现体系中水的转移，可以连续除去 反应过程中生成的水，从而使反应平衡向合成方向移动，适用反应过程中生成的水，从而使反应平衡向合成方向移动，适用 于于大规模生产大规模生产 酶的非水相催化(4)27 (6)水合盐对法：水合盐对法：

33、 o通过直接向反应体系中通过直接向反应体系中加入水合盐加入水合盐对来控制体系水含量，一种对来控制体系水含量，一种 水合盐对可得到一个特定的水蒸气压，不同的水合盐对产生相水合盐对可得到一个特定的水蒸气压，不同的水合盐对产生相 应的水含量。由水合盐与其无水形式构成的盐对可以应的水含量。由水合盐与其无水形式构成的盐对可以对体系中对体系中 的的AwAw起缓冲作用起缓冲作用。 o以以Na2HPO4为例说明其作用原理，体系中加入为例说明其作用原理，体系中加入Na2HPO4，假定，假定 反应过程中有水生成，当反应进行到一定程度，体系中积累足反应过程中有水生成，当反应进行到一定程度，体系中积累足 够多的水时部

34、分够多的水时部分Na2HPO4结合水形成结合水形成Na2HPO42H20形式，从而形式，从而 体系中的盐以体系中的盐以Na2HPO4Na2HPO42H20盐对盐对的形式存在，随着的形式存在，随着 体系中水的积累，无水盐不断转化为二水盐，在全部转化之前体系中水的积累，无水盐不断转化为二水盐，在全部转化之前 体系体系Aw不变。当无水盐全部转化为二水盐后，水的进一步产生不变。当无水盐全部转化为二水盐后，水的进一步产生 和积累会引起体系和积累会引起体系Aw的提高，直至水的量足以使二水盐转化为的提高，直至水的量足以使二水盐转化为 七水盐，形成七水盐，形成Na2HPO42H20Na2HPO47H20盐对盐

35、对，从而将体，从而将体 系系Aw维持在另一水平。维持在另一水平。 酶的非水相催化(4)28 讨论：水活度对酶活性的影响讨论：水活度对酶活性的影响 （1 1）通常最佳水含量会随着溶剂极性增加而增加：）通常最佳水含量会随着溶剂极性增加而增加： o溶剂和底物性质对酶活性也有着直接或间接的影响，溶剂和底物性质对酶活性也有着直接或间接的影响， 底物对水也有强的吸附；底物对水也有强的吸附； o脂肪酶脂肪酶在己烷中催化丁酸和丁醇的酯化反应时，当反在己烷中催化丁酸和丁醇的酯化反应时，当反 应物浓度增加到应物浓度增加到0.37molL时得到一个恒定的最佳水时得到一个恒定的最佳水 活度活度0.78。 酶的非水相催

36、化(4)29 （2）酶因为结构不同导致维持酶所具有的活性构象所必）酶因为结构不同导致维持酶所具有的活性构象所必 需的水量也不同：需的水量也不同： o 大部分酶需要较高的水活度才能表现出较好的活性大部分酶需要较高的水活度才能表现出较好的活性：-葡萄葡萄 糖苷酶、酪氨酸酶糖苷酶、酪氨酸酶Aw0.7才能测出催化活性；才能测出催化活性；-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 每个分子需要数十个水分子活化，而每个分子需要数十个水分子活化，而酪氨酸酶、醇脱氢酶酪氨酸酶、醇脱氢酶每个每个 分子需要几百个水分子才能活化；分子需要几百个水分子才能活化； o同一种酶若来源不同所需的水量也会有显著不同同一种酶若来源不同所需的水

37、量也会有显著不同：Rhizopus arrhizus脂肪酶（低脂肪酶（低Aw）、）、Pseudomonas sp脂肪酶（随着脂肪酶（随着Aw 的增加活性提高）、的增加活性提高）、Candida rugosa脂肪酶（脂肪酶（Aw较宽）；较宽）； o在不同的反应中酶所需要的最适水量也不同在不同的反应中酶所需要的最适水量也不同：酯化反应中，：酯化反应中， 水作为酰基酶的一个亲核试剂与醇底物竞争，随着水活度的增水作为酰基酶的一个亲核试剂与醇底物竞争，随着水活度的增 加，酶底物的加，酶底物的Km值会提高许多倍值会提高许多倍(1020倍倍)。 酶的非水相催化(4)30 （3）酶中水的位置也要正确：）酶中水

38、的位置也要正确： o枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶经超声波处理后酶活显著提高，可能是由于结经超声波处理后酶活显著提高，可能是由于结 合在酶蛋白中的水分子重新排布造成的；合在酶蛋白中的水分子重新排布造成的； （4）酶活性位点的运动性随着水的加入显著增加）酶活性位点的运动性随着水的加入显著增加 （水能提高蛋白质结构区域的柔性及其活性位点的极性）（水能提高蛋白质结构区域的柔性及其活性位点的极性）： o乙醇脱氢酶、枯草杆菌蛋白酶、四氢呋喃中细胞色素乙醇脱氢酶、枯草杆菌蛋白酶、四氢呋喃中细胞色素C、胶原蛋、胶原蛋 白、弹性蛋白、溶菌酶白、弹性蛋白、溶菌酶 酶的非水相催化(4)31 （5 5）蛋白质分子的极

39、性和带电基团的水合作用对于酶的）蛋白质分子的极性和带电基团的水合作用对于酶的 催化是必要的：催化是必要的： o由于在干的状态下，酶分子的带电基团和极性基团互相作用产由于在干的状态下，酶分子的带电基团和极性基团互相作用产 生一个失活的生一个失活的锁住的构象锁住的构象，水与这些功能基团形成氢键，屏蔽水与这些功能基团形成氢键，屏蔽 离子化基团之间的静电作用离子化基团之间的静电作用，并且中和了折叠多肽链中的肽单，并且中和了折叠多肽链中的肽单 元和极性侧链基团之间的偶极相互作用。静电相互作用在控制元和极性侧链基团之间的偶极相互作用。静电相互作用在控制 有机介质中酶的催化行为方面可能起主要作用。有机介质中

40、酶的催化行为方面可能起主要作用。 o通过向溶剂中加入各种通过向溶剂中加入各种“氢键形成物氢键形成物”( (例如例如甘油、乙二醇和甲甘油、乙二醇和甲 酰胺酰胺) )验证了这个假设，其中加入验证了这个假设，其中加入3 3甲酰胺会使在辛醇甲酰胺会使在辛醇( (含含1 1 水水) )中的中的多酚氧化酶多酚氧化酶的活性提高的活性提高3535倍。倍。 酶的非水相催化(4)32 2 2、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响 有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分 之一。常用的有机溶剂可分为两大类：之一。常用的有机溶剂可分为两大类：

41、o一是一是水溶性有机溶剂水溶性有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、，如甲醇、乙醇、丙醇、 正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等；正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等； o二是二是水不溶性的有机溶剂水不溶性的有机溶剂，如石油醚、己烷、，如石油醚、己烷、 庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊 醚等。醚等。 酶的非水相催化(4)33 （1 1）有机溶剂对酶结构的影响：）有机溶剂对酶结构的影响： o破坏酶的空间结构甚至引起酶的变性失活：破坏酶的空间结构甚至引起酶的变性失活： 碱性磷酸酶碱性磷酸酶悬浮于悬浮于乙腈乙腈中中20h20h（6060以上的酶不可逆变性失活）；以上的酶不可逆变性

42、失活）； 悬浮在悬浮在丙酮丙酮中中36h36h（7575以上的酶呈现不可逆失活）以上的酶呈现不可逆失活） o对酶的表面结构和活性中心产生一定的影响但对酶的表面结构和活性中心产生一定的影响但 其整体结构和活性中心基本上保持完整：其整体结构和活性中心基本上保持完整： 脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等 酶的非水相催化(4)34 有机介质酶反应体系中的有机溶剂本身对酶促反应有机介质酶反应体系中的有机溶剂本身对酶促反应 主要通过以下三种途径发生作用：主要通过以下三种途径发生作用： 直接与酶发生作用干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，直接与酶发生作用干扰氢键和疏水键等改变酶的构象， 从

43、而导致酶的活性被抑制或失活：从而导致酶的活性被抑制或失活： oa a、枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶晶体原有晶体原有119119个与酶分子结合水分个与酶分子结合水分 子，悬浮在子，悬浮在乙腈乙腈中后，与酶分子结合的水分子只有中后，与酶分子结合的水分子只有9999 个，有个，有1212个乙腈分子结合到酶分子中，其中有个乙腈分子结合到酶分子中，其中有4 4个是原个是原 来水分子结合位点；来水分子结合位点； ob b、辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶在在甲醇甲醇中催化时，甲醇分子可以进中催化时，甲醇分子可以进 入酶的活性中心，与卟啉铁配位结合。入酶的活性中心，与卟啉铁配位结合。 酶的非水相催化(4)35

44、有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用，有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用， 影响正常反应的进行；影响正常反应的进行； 有机溶剂还可以直接和酶分子周围水相互作用：有机溶剂还可以直接和酶分子周围水相互作用： o一般认为在非水相反应体系中一般认为在非水相反应体系中极性强的有机溶剂极性强的有机溶剂对酶对酶 的催化活性不利，因为它们会的催化活性不利，因为它们会剥夺酶表面微环境中的剥夺酶表面微环境中的 必需水而使酶失活必需水而使酶失活，所以在多数情况下，酶在疏水性，所以在多数情况下，酶在疏水性 强的有机溶剂中保持较高的活性。强的有机溶剂中保持较高的活性。 o研究证明在研究证明在非水介质非水介质中

45、加入乙二醇、多元醇聚合物、中加入乙二醇、多元醇聚合物、 大环有机物均可起到稳定酶或增强其活性及选择性的大环有机物均可起到稳定酶或增强其活性及选择性的 作用。作用。 酶的非水相催化(4)36 （2 2）有机溶剂对酶活力的影响：）有机溶剂对酶活力的影响： oLaane深入研究了溶剂的理化性质与酶功能的相关性，其中包括深入研究了溶剂的理化性质与酶功能的相关性，其中包括 希尔德布兰德溶解度参数希尔德布兰德溶解度参数()、介电常数、介电常数()、偶极距、偶极距()以及分配以及分配 系数的对数系数的对数(lgP)等，发现等，发现lgP与酶活力之间具有最好的相关性：与酶活力之间具有最好的相关性： lgP越大

46、，溶剂的疏水性越强越大，溶剂的疏水性越强;lgP越小，溶剂的亲水性越强越小，溶剂的亲水性越强。将。将 常用的常用的30多种有机溶剂根据其在水中的溶解度分为三类：多种有机溶剂根据其在水中的溶解度分为三类： 常用有机溶剂的分类及对酶活性影响规律常用有机溶剂的分类及对酶活性影响规律 酶的非水相催化(4)37 酶在不同性质有机溶剂中的催化反应研究结果表明，酶活酶在不同性质有机溶剂中的催化反应研究结果表明，酶活 力与力与lgP之间存在以下相关性：之间存在以下相关性： o在在lgP2的极性溶剂的极性溶剂中，酶具较低催化活力，极性溶剂会强烈中，酶具较低催化活力，极性溶剂会强烈 地扰动水与催化剂之间的相互作用

47、，导致酶二级结构（地扰动水与催化剂之间的相互作用，导致酶二级结构（a-螺旋螺旋 和和-折叠）及高级结构出现脱稳而活性丧失；折叠）及高级结构出现脱稳而活性丧失； o在在2lgP4的中等极性溶剂的中等极性溶剂中，酶常常表现出中等催化活力，中，酶常常表现出中等催化活力， 具有较弱的水扰动能力，影响的程度与酶的特性和体系性质有具有较弱的水扰动能力，影响的程度与酶的特性和体系性质有 关；关； o在在lgP4的非极性溶剂的非极性溶剂中，酶有较高的催化活力，非极性溶剂中，酶有较高的催化活力，非极性溶剂 通常不会扰动酶的必需水层。通常不会扰动酶的必需水层。 酶的非水相催化(4)38 （3 3）有机溶剂对底物和

48、产物分配的影响：）有机溶剂对底物和产物分配的影响： o酶在有机介质中进行催化反应，酶在有机介质中进行催化反应，酶的作用底物首先必须进入必酶的作用底物首先必须进入必 需水层需水层，然后才能进入酶的活性中心进行催化反应然后才能进入酶的活性中心进行催化反应。反应后生。反应后生 成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到 有机溶剂中，而产物也必须移出必需水层，酶催化反应才能继有机溶剂中，而产物也必须移出必需水层，酶催化反应才能继 续进行下去。有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的续进行下去。有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的

49、 浓度。浓度。 o如果如果有机溶剂的极性很小，疏水性太强有机溶剂的极性很小，疏水性太强，则，则疏水性底物疏水性底物虽然在虽然在 有机溶剂中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需有机溶剂中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需 水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催 化速度；化速度； o如果如果有机溶剂的极性过大，亲水性太强有机溶剂的极性过大，亲水性太强，则，则疏水性底物疏水性底物在有机在有机 溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也使催化速度减慢。溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也使催化速度减慢。 酶的非水相催化(4)

50、39 （4 4）有机溶剂对酶活性和选择性的调节）有机溶剂对酶活性和选择性的调节： o有机溶剂对酶活性的调节有机溶剂对酶活性的调节 原原 因因 分析说明分析说明 减少或消除的措施减少或消除的措施 扩散性限制扩散性限制大多数如此认为大多数如此认为充分搅动酶反应体系或使用小颗粒酶充分搅动酶反应体系或使用小颗粒酶 活性中心的封闭活性中心的封闭只造成几倍的酶活力下降只造成几倍的酶活力下降严重时可采用晶体酶严重时可采用晶体酶 酶蛋白构象变化酶蛋白构象变化在冻干酶过程中或其他脱在冻干酶过程中或其他脱 水过程中易产生水过程中易产生 使用保护剂，或在有机相中使用两性使用保护剂，或在有机相中使用两性 分子制备酶的

51、复合体分子制备酶的复合体 底物脱离溶剂，束底物脱离溶剂，束 缚能力差缚能力差 对疏水性溶剂会使酶活力对疏水性溶剂会使酶活力 减少减少l00l00倍左右倍左右 选择合适溶剂，产生合适溶剂与底物选择合适溶剂，产生合适溶剂与底物 的作用的作用 过渡态的不稳定性过渡态的不稳定性过渡态部分暴露在溶剂中产过渡态部分暴露在溶剂中产 生的不稳定性生的不稳定性 选择能够产生与过渡态相适合的溶剂选择能够产生与过渡态相适合的溶剂 酶的非水相催化(4)40 有机溶剂对酶选择性的调节：有机溶剂对酶选择性的调节： o有机溶剂中酶结构的有机溶剂中酶结构的刚性刚性增强，从而为有机溶剂调节增强，从而为有机溶剂调节 酶功能提供了

52、一种可能的手段，也即利用有机溶剂的酶功能提供了一种可能的手段，也即利用有机溶剂的 性质来调节酶的选择性（溶剂工程）。性质来调节酶的选择性（溶剂工程）。 o酶在不同酶在不同介电常数介电常数的有机溶剂中，其分子结构刚性程的有机溶剂中，其分子结构刚性程 度不同。在度不同。在低介电常数低介电常数的有机溶剂如乙腈中柔性要比的有机溶剂如乙腈中柔性要比 高介电常数的有机溶剂如二嗯烷中要高。当酶处于高高介电常数的有机溶剂如二嗯烷中要高。当酶处于高 介电常数的有机溶剂中时酶分子介电常数的有机溶剂中时酶分子柔性降低柔性降低，S-S-型异构型异构 体遇到的空间障碍减少，酶反应活性增大，导致酶的体遇到的空间障碍减少，

53、酶反应活性增大，导致酶的 对映体选择性减小。对映体选择性减小。 酶的非水相催化(4)41 7.47.4、酶在有机介质中的催化特性、酶在有机介质中的催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别， 对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从 而显示出与水相介质中不同的催化特性：而显示出与水相介质中不同的催化特性： o底物特异性底物特异性 o对映体选择性对映体选择性 o区域选择性区域选择性 o键选择性键选择性 o热稳定性热稳

54、定性 opH“记忆记忆”与与pH “忘记忘记” 酶的非水相催化(4)42 底物特异性（底物专一性）底物特异性（底物专一性） o酶在水溶液中进行催化反应，酶在水溶液中进行催化反应，具有高度的底物专一性具有高度的底物专一性，是酶催，是酶催 化反应的显著特点之一。在有机介质中，由于酶分子活性中心化反应的显著特点之一。在有机介质中，由于酶分子活性中心 的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底 物特异性发生改变。有机溶剂具有不同的极性，所以在有机介物特异性发生改变。有机溶剂具有不同的极性，所以在有机介 质中，酶的底物专一性会发生改变。质

55、中，酶的底物专一性会发生改变。 例如例如胰蛋白酶胰蛋白酶等蛋白酶在催化等蛋白酶在催化N-N-乙酰乙酰-L-L-丝氨酸乙酯丝氨酸乙酯和和N-N-乙酰乙酰- - L-L-苯丙氨酸乙酯苯丙氨酸乙酯的水解反应时：的水解反应时： o在在水溶液水溶液中，后者比前者催化水解的速度快中，后者比前者催化水解的速度快10104 4倍；倍； o在在辛烷介质辛烷介质中，前者比后者催化水解的速度快中，前者比后者催化水解的速度快2020倍。倍。 酶的非水相催化(4)43 对映体选择性对映体选择性 o酶的对映体选择性又称为酶的对映体选择性又称为立体选择性立体选择性或或立体异构专一性立体异构专一性，是酶，是酶 在对称的外消旋

56、化合物中识别一种异构体能力大小的指标。酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体能力大小的指标。酶 立体选择性的强弱可以用立体选择系数立体选择性的强弱可以用立体选择系数(K(KLD LD) )的大小来衡量。 的大小来衡量。 式中，KLD立体选择系数； LL-型异构体； DD-型异构体； Km米氏常数； Kcat酶的转换数 KLD= Kcat KmL Kcat KmD 酶的非水相催化(4)44 o酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性 强的有机介质中，酶的立体选择性较差。强的有机介质中，酶的立体选择性较差。 例如例如蛋白酶：蛋白酶： o在在水溶液水溶

57、液中，只对含有中，只对含有L-L-氨基酸氨基酸的蛋白质作用，水解生成的蛋白质作用，水解生成 L-L-氨基酸；氨基酸； o在在有机介质有机介质中，可以用中，可以用D-D-氨基酸氨基酸为底物合成由为底物合成由D-D-氨基酸组氨基酸组 成的多肽等。成的多肽等。 o这一点在这一点在手性药物手性药物的制造中有重要应用。的制造中有重要应用。 酶的非水相催化(4)45 区域选择区域选择 o酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择 底物分子中某一区域的底物分子中某一区域的基团优先基团优先进行反应。酶区域选择性的强进行反应。酶区域选择性的强 弱

58、可以用区域选择系数弱可以用区域选择系数Ks.tKs.t的大小来衡量。区域选择系数与立的大小来衡量。区域选择系数与立 体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置s,ts,t代替异构体的代替异构体的 构型构型L L，D D。 Ks,t= Kcat Kms Kcat Kmt 酶的非水相催化(4)46 o例如例如脂肪酶脂肪酶催化催化1，4-二丁酰基二丁酰基-2-辛基苯辛基苯与与丁醇丁醇之间之间 的转酯反应的转酯反应: o在在甲苯介质甲苯介质中，区域选择系数中，区域选择系数K K4,1 4,1=2 =2，表明酶优先作，表明酶优先作 用于底物用于底物C4C4位上的酰基

59、；位上的酰基； o在在乙腈介质乙腈介质中，区域择系数中，区域择系数K K4,1 4,1=0.5 =0.5，则表明酶优先，则表明酶优先 作用于底物作用于底物C1C1位上的酰基。位上的酰基。 o从而得出在两种不同的介质中从而得出在两种不同的介质中区域选择系数相差区域选择系数相差4 4倍倍。 酶的非水相催化(4)47 键选择性键选择性 o即在同一个底物分子中有即在同一个底物分子中有2 2个以上的化学键都可以与酶反应时，个以上的化学键都可以与酶反应时， 酶对其中一种酶对其中一种化学键优先化学键优先进行反应。进行反应。 o键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。

60、例如例如脂肪酶脂肪酶催化催化6-6-氨基氨基-1-1-己醇己醇酰化反应酰化反应，底物分子中的，底物分子中的氨基氨基 和和羟基羟基都可能被酰化分别生成都可能被酰化分别生成肽键肽键和和酯键酯键： o采用采用黑曲霉脂肪酶黑曲霉脂肪酶催化时，催化时，羟基酰化羟基酰化占绝对优势；占绝对优势； o采用采用毛霉脂肪酶毛霉脂肪酶催化时，催化时，氨基酰化占氨基酰化占绝对优势；绝对优势； o在不同的在不同的有机介质有机介质中，氨基酰化与羟基酰化程度也有所不同。中，氨基酰化与羟基酰化程度也有所不同。 酶的非水相催化(4)48 热稳定性热稳定性 o许多酶在有机介质中热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。许多酶在有机介质