血红蛋白的提取和分离

1、波峰中学高二生物理班课前双基预习案 a （课前）班级： 姓名:编制：陈芳 审核：赵玉春 审定： 编号:i专题五dna和蛋白质技术 课题3血红蛋白的提取和分离（第1课时） 【学习目标】1 .熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；2 .掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。【完成目标】目标一原理提取和分离蛋白质的原理：蛋白质的各种特性的差异：如分子的、所带的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的 等，由此提取和分离各 种蛋白质。（一）凝胶色谱法1 .凝胶色谱法也称做 ,是根据 分离蛋白质的有效方法。2 .原理：相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不

2、同，相对分子质量较小的蛋 白质 进入凝胶内部的通道，路程 ,移动速度 ;而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ,移动速 度 o相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。3 .具体过程:多孔板(5)a. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。b. (1)蛋白质混合物;(2) 开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的 蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；(3)相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质 移动。(4) 不同的蛋白质分子完全分开；(5) 的蛋白质行程较短，已从层析柱中

3、洗脱出来， 的蛋白 质还在行进中。(二)缓冲溶液1 .缓冲溶液的作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制 对溶液ph的影响，而保 持。2 .缓冲溶液通常由12种 溶解于水配制而成。调节 可以制成在不同ph范围内使用的缓冲液。【思考11维持人体血液ph稳态的缓冲对有 。 (三)电泳1 .概念：电泳是指 在 的作用下发生 的过程。2 .原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有可解离的基团，在一定的 ph下， 这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移 动。3 .在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子 ,决定带电分子迁移快 慢的是带电分子 、电量的不同。4 .常用的电泳方法是

4、和,在测定蛋白质分子量时通常 使用。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。为了消除样品分子原有净电量对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入,使样品分子的迁移速率完全取决于 。波峰中学高二生物课后限时作业b基础题1、下列有关叙述错误.的是（）a.用醋酸菌制作果醋时，需通入氧气b.利用凝胶色谱法可分离相对分子质量不同的蛋白质c.进行dna粗提取时，用酒精提取含杂质较少的 dnad.接种前需对培养基、培养皿、实验操作者的双手等进行灭菌处理2、关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是（）a.分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来b.抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂c.蛋

5、白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质d.蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物3、下列有关生物技术实验的叙述，正确的是（）a.制作果酒和制作果醋所需的发酵底物、适宜温度等均相同b.在植物组织培养过程中，制备的 ms养基需要用酒精消毒c.用二苯胺鉴定dnaf口用斐林试剂检测还原糖时均需要水浴加热d.用凝胶色谱法分离蛋白质时，与分子量较小的蛋白质相比，血红蛋白移动较慢4、下图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质，在凝胶中的行进过程的是（）abc5、下列对红细胞和血红蛋白的描述，错误的是 （）a .哺乳动物成熟的红细胞可用于制备细胞膜和提取血红蛋白的生物材料b.血红蛋白属于细胞外液的成分，其组成元素

6、有c、h、o、n、fec.血红蛋白的纯化可用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量大小分离蛋白质d.蛙的红细胞可进行无丝分裂，其特征是没有出现纺锤丝和染色体的变化6、在血红蛋白的提取过程中，要使用磷酸缓冲液处理的作用是（）a.防止血红蛋白被氧气氧化b.血红蛋白是一种碱性物质，需磷酸中和c.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程d.让血红蛋白处在稳定的ph范围内，维持其结构和性质7、下列关于提取和分离蛋白质的步骤正确的是 （）a.样品处理、凝胶色谱操作、sds一聚丙烯酰胺凝胶电泳b.样品处理、凝胶色谱操作、纯化c.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定d.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定8、利用凝胶色谱法分

7、离蛋白质的原理是（）a.蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小b.蛋白质相对分子质量的大小c.蛋白质所带电荷的多少d.蛋白质溶解度的大小9、用凝胶色谱法分离相对分子质量小的蛋白质时，下列说话正确的是()a.路程较长，移动速度较慢b 路程较长，移动速度较快c.路程较短，移动速度较慢d.路程较短，移动速度较快10、凝胶常在分离蛋白质时使用，其的种类很多，但都有相同的作用是()a.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径b 吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度c.将酶或细胞固定在凝胶中d.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度11、下列对样品的加入以及洗脱的操作错误的是()a.加样前，打开色谱柱下端的

8、流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面b 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内c.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口d.用吸管小心地将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面12、下列提纯猪血红蛋白的叙述错误的是()a 洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂b 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少c.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测d.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢13、为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研人员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如图。请回答：(1) 与 利 用 游 离 酵 母

9、 生 产 啤 酒 相 比 ， 利 用 固 定 化 酵 母 的 优 点 有(2)本实验结果表明，随氯化钙浓度的增大，凝胶珠机械强度增大，完整率。(3)结合发酵性能分析，制备凝胶珠适宜的氯化钙浓度为 。当氯化钙浓度过高时，发酵液中的糖度升高，酒精度下降，发酵受到影响，原因是（4）用海藻酸钠作为载体包埋酵母细胞，溶解海藻酸钠时最好采用 的方法，以防发生焦糊。溶化好的海藻酸钠溶液应 后，再与已活化的酵母细胞充分混合。若海藻酸钠浓度过低，会导致,固定效果大大降低。波峰中学高二生物理班课前双基预习案 a （课前）班级： 姓名:编制：陈芳 审核：赵玉春 审定： 编号:专题五dna和蛋白质技术 课题3血红蛋白

10、的提取和分离（第2课时） 【学习目标】1 .熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；2 .掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。 【完成目标】目标二实验操作蛋白质的提取和分离的一般分为四步： 、和。 （一）样品处理及粗分离1 .红细胞的洗涤洗涤的目的是去除 ,以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝周，应预先加入 ;所用洗涤液是一倍于红细胞液的 ;洗涤中用玻璃 棒,用离心机 离心；洗涤干净的标准是 。2 .血红蛋白的释放： 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。3 .分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 m

11、in , 试管中的溶液分为4层：第1层（最上层）：甲苯层第2层（中上层）： 的沉淀层，色薄层固体第3层（中下层）： 的水溶液层，的液体第4层（最下层）：其它杂质的 沉淀层将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下 层的红色透明液体，即 溶液。4 .透析 将血红蛋白溶液装入 中，放入 中透析12h0透析的目的是除去血红蛋白溶液中的 物质。（二）凝胶色谱操作1 .第一步要制作,第二步要,因 为 ,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要 的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。第三步是 。52 . (1)凝胶的选择：。(2)方法：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量

12、的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配 成。(3)凝胶色谱柱的装填方法固定：将色谱柱垂直固定在支架上装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。洗涤平衡装填完毕后，用 充分洗涤平衡12h,使凝胶装填。3 .样品加入与洗脱(1)加样前：打开 下端流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与(2)加透析样品：用吸管沿 将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏 。(3)洗脱和收集：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱，待 接近色谱柱 时,用试管收集流出液，(三)sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度三、操作提示1 .红细胞

13、的洗涤时，洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高或离心时间过长，会使 等一同沉淀。2 .为了加快凝胶膨胀，可以将加入 的湿凝胶用 加热，不仅节约时间，还能除去凝胶中的 和。3 .凝胶色谱柱中不能存在气泡，原因是气泡会 降低分离 效果。思考2:你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即 ;然后通过凝胶色谱法将相对分子质 量较大杂质蛋白除去，即样品的 ;最后经聚丙烯酰胺凝胶

14、电泳进行 。【当堂检测】请将下列实验流程图补充完整:波峰中学高二生物课后限时作业b基础题1、使用sds-聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()a. 电荷的多少b. 分子的大小c. 肽链的多少d. 分子形状的差异2、下列关于提取和分离蛋白质的步骤正确的是()a.样品处理、凝胶色谱操作、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳b. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化c. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定d. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定3、凝胶常在分离蛋白质时使用，其的种类很多，但都有相同的作用是()a.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径b.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度c.将酶

15、或细胞固定在凝胶中d.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度 4、下列对样品的加入以及洗脱的操作错误的是()a.力口样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面b.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内c.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口d.用吸管小心地将1mls析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面5、下列对凝胶色谱柱相关操作过程正确的是( )a. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴b. 将橡皮塞下部用刀切出凹穴c. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面d. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片6、使用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对

16、分子质量时，可选用一组已知相对分子质 量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的相对分子质量。下列说法不正确的是 ( )a.sds能与蛋白质形成复合物而掩盖不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率取决于分子的大小b. 与已知相对分子质量的标准蛋白的电泳带相等，只能估计出待测蛋白质的相对分子质量c.sdst引发剂和催化剂的作用下参与构成聚丙烯酰胺凝胶d. 如果只是分离混合物而不需要测定蛋白质的相对分子质量时， 就无需加入sds， 此时的电泳迁移率取决于所带电荷和分子的大小7、将经处理破裂后的红细胞混合液以20

17、00r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是( )a.血红蛋白、甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、沉淀层 b.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、其他杂质的暗红色沉淀物 c.其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 d.甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、沉淀层提高题8、下列关于血红蛋白的提取和分离实验操作正确的是 ()a.分离红细胞时采用低速长时离心b.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸储水即可c.分离血红蛋白溶液是低速短时离心d.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h9 .凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。凝胶

18、色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的 不同而实现分离的：使用电泳法分离蛋白质.是利用了待分离样品中各种分子的 差异，以及 分子本身的、形状的不同。10 .红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功 能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提 取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程度可分为四步： 、 和。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离 心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是 以上所述的过程即是样品处理，它包括 、收集血红蛋白溶液。(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 o透析的原理是(4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴样品纯化的目的是血红蛋白有什么特点？ 这一特点对进行蛋白质的 分离有什么意义？ j10参考答案一、单项选择1、【答案】d2、 【答案】c3、 【答案】c