湖工酶工程第七章

1、第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 第七章第七章 核核 酶酶 具有生物催化功能的核酸，称为具有生物催化功能的核酸，称为核酶核酶，其化学本质是，其化学本质是 核酸，但具有酶的特异性催化作用。核酸，但具有酶的特异性催化作用。 具有生物催化功能的具有生物催化功能的DNA分子，称为分子，称为脱氧核酶脱氧核酶。 核酶及脱氧核酶的发现，推翻了酶的化学本质只是蛋核酶及脱氧核酶的发现，推翻了酶的化学本质只是蛋 白质的传统观念。白质的传统观念。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 第一节第一节 核核 酶酶 第二节第二节 脱脱 氧氧 核核 酶酶 第三

2、节第三节 核酶的应用核酶的应用 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 第一节第一节 核核 酶酶 核酶最早由核酶最早由Cech和和Altman分别于分别于19811981年和年和19831983年研究年研究 四膜虫的四膜虫的rRNA和细菌的和细菌的RNaseP时发现。时发现。 化学本质化学本质：RNA；作用作用：参与细胞内：参与细胞内RNA及前体的加及前体的加 工和成熟过程；工和成熟过程；底物底物：多为：多为RNA，也有一些是，也有一些是DNA、氨基、氨基 酸酯；酸酯；催化效率催化效率：比蛋白质酶低得多，且需要金属离子的辅：比蛋白质酶低得多，且需要金属离子的辅 助；

3、助；催化反应类型催化反应类型：水解作用、连接作用、转核苷酸作用。：水解作用、连接作用、转核苷酸作用。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 结构特点结构特点：I型内含子、型内含子、II型内含子、型内含子、RNaseP的的RNA亚亚 基、发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎基、发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎病毒核酶、病毒核酶、VS核酶。核酶。 分子大小分子大小：大分子核酶和小分子核酶。大分子核酶包括：大分子核酶和小分子核酶。大分子核酶包括 I型内含子、型内含子、II型内含子、型内含子、RNaseP的的RNA亚基。小分子核酶亚基。小分子核酶 包括发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎包括

4、发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎病毒核酶、病毒核酶、VS核酶。核酶。 作用机制作用机制：剪接型核酶和剪切型核酶。：剪接型核酶和剪切型核酶。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 一、剪接型核酶一、剪接型核酶 既可以剪切，又可以连接的核酶，即先通过剪切去掉既可以剪切，又可以连接的核酶，即先通过剪切去掉 自身自身RNA内一个核苷酸片段，再将剪切后剩下的两个片段内一个核苷酸片段，再将剪切后剩下的两个片段 连接起来，从而实现连接起来，从而实现RNA前体的自我拼接。前体的自我拼接。 （一）（一）I 型内含子的自我剪接型内含子的自我剪接 广泛分布于细胞器基因和核基因中，噬菌体中也

5、有。广泛分布于细胞器基因和核基因中，噬菌体中也有。 代表分子有：四膜虫大核代表分子有：四膜虫大核26SrRNA前体、酵母线粒体中前体、酵母线粒体中 Cytb的的mRNA前体、前体、T4噬菌体胸腺嘧啶合成酶噬菌体胸腺嘧啶合成酶mRNA前体前体 等。等。I型内含子在体外的催化反应需要型内含子在体外的催化反应需要Mg2+和鸟苷或和鸟苷或5 5/ /- -鸟苷鸟苷 酸参与酸参与。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 I I型内含子的剪切机制（过程）：型内含子的剪切机制（过程）：L-19 IVS rRNA前体中的前体中的IVS发生折叠发生折叠，形，形 成一定的空间构象；成

6、一定的空间构象； 由一个鸟嘌呤核苷由一个鸟嘌呤核苷G的的3/-OH作为作为 亲核基团攻击亲核基团攻击5/端剪接位点的磷酸二酯键端剪接位点的磷酸二酯键， 使使5/端脱落端脱落，鸟嘌呤核苷与内含子序列的，鸟嘌呤核苷与内含子序列的5/ 端形成新的磷酸二酯键端形成新的磷酸二酯键，5/端外显子的端外显子的3/端端 生成羟基。该反应为一次转酯反应。生成羟基。该反应为一次转酯反应。 5/端外显子的端外显子的3/-OH成为亲核基团，成为亲核基团， 攻击攻击3/端外显子与内含子之间的磷酸二酯端外显子与内含子之间的磷酸二酯 键，形成新的磷酸二酯键，两个外显键，形成新的磷酸二酯键，两个外显 子序列连接起来，同时释放

7、出子序列连接起来，同时释放出IVSIVS。此为第二次转酯。此为第二次转酯。 释放出的线性释放出的线性IVSIVS又经过两又经过两 次转酯反应分别释放出次转酯反应分别释放出1515个和个和4 4个核苷酸片段，形成一个稳定的线性个核苷酸片段，形成一个稳定的线性IVSIVS。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 （二）（二）II 型内含子的自我剪接型内含子的自我剪接 主要存在线粒体中，在真菌、原核生物、植物的主要存在线粒体中，在真菌、原核生物、植物的rRNA、 tRNA、mRNA中均有发现。中均有发现。 II型内含子与型内含子与I型内含子的剪接机制相类似，也是通过型内

8、含子的剪接机制相类似，也是通过 两次转酯反应，但不需要鸟苷的辅助。两次转酯反应，但不需要鸟苷的辅助。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 内含子中一个保守的内含子中一个保守的 腺嘌呤残基的腺嘌呤残基的2/ -OH 亲核攻击亲核攻击 5/端剪接位点的磷酸二酯键，端剪接位点的磷酸二酯键， 并结合形成一个套环并结合形成一个套环； 被切下的被切下的5/端外显子的端外显子的 3/ -OH对内含子对内含子3/端剪接位点端剪接位点 进行亲核攻击，外显子连接起进行亲核攻击，外显子连接起 来，释放出套环状的内含子。来，释放出套环状的内含子。 IIII型内含子自我剪接过程示意图型内

9、含子自我剪接过程示意图 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 二、剪切型核酶二、剪切型核酶 催化自身或异体分子切割的核酶，其作用相当于核酸催化自身或异体分子切割的核酶，其作用相当于核酸 内切酶。内切酶。 （一）自我剪切型（一）自我剪切型 包括植物类病毒包括植物类病毒RNA、植物病毒的卫星、植物病毒的卫星RNA及肝炎及肝炎 病毒核酶。病毒核酶。 特点：特点：只切（剪）不接，在只切（剪）不接，在Mg2+或其他二价金属离子或其他二价金属离子 存在下，在特点位点进行自我剪切，存在下，在特点位点进行自我剪切，形成形成5/ -OH和和2/ ,3/ -环磷环磷 酸二酯末端酸二酯

10、末端。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 1. 1. 锤头状核酶锤头状核酶 包括包括类病毒类病毒和和拟病毒拟病毒两类。两类。 催化机理：催化机理： 单金属离子催化单金属离子催化：由金属氢氧化物作为广义碱进攻：由金属氢氧化物作为广义碱进攻2/ - OH，活化的，活化的2/ -OH作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸基团。作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸基团。 双金属离子催化双金属离子催化：A位点的金属离子接受位点的金属离子接受2/氧的电子，氧的电子， 使使2/ -OH去质子更容易。去质子更容易。B位点的位点的金属离子接受金属离子接受5/氧的电子，氧的电子， 使使O-PO

11、-P键极化并使键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出键极化并使键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出 来。来。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 2. 2. 发夹状核酶发夹状核酶 三种植物三种植物RNA病毒的卫星病毒的卫星RNA 。 3.3.肝炎肝炎病毒核酶病毒核酶 是一种缺陷型单链环状是一种缺陷型单链环状RNA病毒。在细胞内的复制过病毒。在细胞内的复制过 程中不产生程中不产生DNA片段，而是以反义基因组片段，而是以反义基因组RNA为模板，在为模板，在 宿主细胞的宿主细胞的RNA聚合酶聚合酶I作用下，通过滚环复制进行作用下，通过滚环复制进行RNA复复 制，复制产生

12、的多聚体，通过自身核酶活性区催化的自身裂制，复制产生的多聚体，通过自身核酶活性区催化的自身裂 解反应，形成若干单体，再在核酶活性区催化分子内连接，解反应，形成若干单体，再在核酶活性区催化分子内连接， 形成环状结构。形成环状结构。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 （二）异体剪切型（二）异体剪切型 RNase P主要催化主要催化tRNA前体成熟过程，能特异性切割前体成熟过程，能特异性切割 所有所有tRNA前体的前体的5/端引导序列，形成端引导序列，形成3/ -OH和和5/-磷酸末端，磷酸末端， 得到成熟的得到成熟的tRNA。 第第 七七 章章 核核 酶酶酶工程酶工程 湖北工业大学湖北工业大学 第二节第二节 脱氧核酶脱氧核酶 具有催化功能的单链具有催化功能的单链DNA分子称为分子称为脱氧核酶脱氧核酶，又称酶，又称酶 性性DNA。 脱氧核酶所具有的催化功能：脱氧核酶所具有的催化功能： 具有水解酶活性；具有水解酶活性； 具有具有N-糖基化酶活性；糖基化酶活性； 具有连接酶活性；具有连接酶活性； 具有其他酶活性：具有其他酶活性： a. 具有