肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法

1、1 恶性肿瘤恶性肿瘤常见病、多发病常见病、多发病 全世界每年全世界每年700700万死亡；占欧美死亡第二位万死亡；占欧美死亡第二位 我国城市居民第一位，农村第三位我国城市居民第一位，农村第三位 恶性肿瘤恶性肿瘤人类健康重要人类健康重要杀手杀手 2 3 4 第一节第一节 自发性肿瘤动物模型自发性肿瘤动物模型 5 一、自发性乳腺癌模型一、自发性乳腺癌模型 生长在体表生长在体表, ,易早期发现易早期发现, ,罕有自发消退罕有自发消退, ,因而因而 能准确观察其大小与生长速度能准确观察其大小与生长速度, ,便于进行实验。便于进行实验。 6 现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型

2、C3H小鼠：小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为 85%85%100%100%。 A系小鼠：系小鼠： 经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30%30%80%80%。 CBA小鼠小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为雌鼠自发性乳腺癌发生率为60%60%65%65%。 7 在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每 只小鼠常见只小鼠常见1 1个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小 相近的动物相近的动物, , 配对分组配对分组, ,给予受试药给予受试药, ,观察受试观察受试 药对肿瘤发展的影响。药对肿瘤发展的影

3、响。 给药方案和给药途径可根据受试药物的特给药方案和给药途径可根据受试药物的特 点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用 间歇给药或小剂量连续给药较为合适。间歇给药或小剂量连续给药较为合适。 8 结果判定结果判定 给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时 间和位置。间和位置。 肿瘤结节长到一定程度肿瘤结节长到一定程度, ,每周用每周用脚规脚规测量皮下测量皮下 肿瘤肿瘤2 2次。测定肿块的最大径次。测定肿块的最大径(a)(a)和最小径和最小径( (b)b)。 9 将将肿瘤体积肿瘤体积变化对变化对时间时间作出生长曲线作出生

4、长曲线, ,可由曲可由曲 线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用, ,尤尤 其应观察肿瘤能否完全消退。其应观察肿瘤能否完全消退。 10 1 1. .在同一品系内在同一品系内, ,发病率比较稳定发病率比较稳定, ,而不同品而不同品 系间差别甚大。系间差别甚大。 2 2. .动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子 ( (即致乳癌病毒即致乳癌病毒) )及激素有关。及激素有关。 3 3. .饲料的变更有明显影响饲料的变更有明显影响, ,要用固定全价营养要用固定全价营养 饲料。饲料。 4 4. .配对分组。配对分组。 11 二、二、AK

5、R白血病模型白血病模型 12 13 自发性肿瘤的总体评价自发性肿瘤的总体评价 14 第二节第二节 诱发性肿瘤动物模型诱发性肿瘤动物模型 15 基本原理基本原理 16 一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法 17 常用的致癌物给予方法和途径常用的致癌物给予方法和途径 1 1. .涂抹法涂抹法: : 涂抹在背部及耳部皮肤涂抹在背部及耳部皮肤, ,主要用主要用 于诱发皮肤肿瘤。于诱发皮肤肿瘤。 2 2. .经口给药法：经口给药法：通过饮水、饲料或灌喂动通过饮水、饲料或灌喂动 物。常用于食道癌、胃癌及大肠癌等。物。常用于食道癌、胃癌及大肠癌等。 3 3. .注射法：注射法：致

6、癌物制成溶液致癌物制成溶液, ,经皮下、肌内、经皮下、肌内、 静脉或体腔等途径注入体内静脉或体腔等途径注入体内, ,本法较常用。本法较常用。 18 常用的致癌物给予方法和途径常用的致癌物给予方法和途径 4 4. .气管注入法：气管注入法：常用于诱发肺癌。常用于诱发肺癌。 5 5. .穿线法：穿线法：将致癌物置于无菌试管内将致癌物置于无菌试管内, ,加加 热使之液化热使之液化, ,吸附于预制的线结上吸附于预制的线结上, ,再将此线再将此线 结穿入靶组织而诱发肿瘤。结穿入靶组织而诱发肿瘤。 6 6. .埋藏法：埋藏法：包埋于皮下或其他组织内。包埋于皮下或其他组织内。 19 二、诱发性肿瘤模型的动物

7、和致癌物二、诱发性肿瘤模型的动物和致癌物 动物：动物：大鼠，小鼠，犬等大鼠，小鼠，犬等 致癌物：致癌物： 多环碳氢类多环碳氢类 亚硝胺类亚硝胺类 偶氮类偶氮类 黄曲霉毒素黄曲霉毒素 （饲料中含（饲料中含0 0.001.0010.015ppm0.015ppm黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1, B1, 喂喂 养养6 6个月个月, ,诱发大鼠肝癌）。诱发大鼠肝癌）。 ppm = parts per million 20 21 诱发性肿瘤模型的总体评价诱发性肿瘤模型的总体评价 22 23 24 25 26 27 移植性肿瘤常用的动物为小鼠、大鼠和地鼠。移植性肿瘤常用的动物为小鼠、大鼠和地鼠。 研究药物的抗肿瘤

8、作用可选择三种或三种以上小研究药物的抗肿瘤作用可选择三种或三种以上小 鼠、大鼠的移植性肿瘤进行实验治疗；抗肿瘤药鼠、大鼠的移植性肿瘤进行实验治疗；抗肿瘤药 物筛选时，每批动物的来源应一致；物筛选时，每批动物的来源应一致； 一、动物的选择一、动物的选择 28 根据瘤株的特点选用近交系、远交系或根据瘤株的特点选用近交系、远交系或F1F1动动 物；雌雄性动物均可应用物；雌雄性动物均可应用( (乳腺癌等必须用雌性乳腺癌等必须用雌性 动物动物) )。 每批实验只用同一性别动物。每批实验只用同一性别动物。 小鼠体重小鼠体重181822g22g，大鼠体重，大鼠体重505070g70g 每组至少每组至少101

9、0只动物，裸鼠可用只动物，裸鼠可用5 51010只。只。 29 二、肿瘤细胞的选择二、肿瘤细胞的选择 复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细胞株复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细胞株 ( (瘤株，瘤株，tumor strain)tumor strain)或细胞系或细胞系(cell line)(cell line)。 细胞株细胞株(cell strain)(cell strain)是指通过选择法或克是指通过选择法或克 隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊 遗传、生化性质或特异标记的细胞群。遗传、生化性质或特异标记的细胞群。 30 瘤株瘤株的组织学类型和生长特征

10、趋于稳定，并的组织学类型和生长特征趋于稳定，并 能在同系、同种或异种动物体内移植并连续传代。能在同系、同种或异种动物体内移植并连续传代。 生长特征，包括接种成活率、生长速度、自生长特征，包括接种成活率、生长速度、自 动消退率、宿主寿命与宿主反应等。动消退率、宿主寿命与宿主反应等。 细胞系：细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为原代培养物经首次传代成功后即为 细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世 系所组成。系所组成。 31 目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、 腹水瘤和白血病）约腹水瘤和白血病）约500500种，

11、还有大量人的瘤种，还有大量人的瘤 株或细胞系。常用的动物移植性肿瘤瘤株或细株或细胞系。常用的动物移植性肿瘤瘤株或细 胞系有：胞系有： 32 肉瘤肉瘤S180S180腹水型或实体型腹水型或实体型 艾氏腹水癌或实体型艾氏腹水癌或实体型 肝癌腹水型（肝癌腹水型（HepAHepA）或实体型（）或实体型（H22H22） 小鼠白血病小鼠白血病L1210L1210、P388P388及及L615L615 小鼠黑色素瘤（小鼠黑色素瘤（B16B16） 小鼠小鼠LewisLewis肺癌肺癌 肉瘤肉瘤S37S37 结肠癌结肠癌C38C38、结肠癌、结肠癌C26C26 子宫颈癌（子宫颈癌（U14U14） 大鼠大鼠Wal

12、kerWalker癌肉瘤癌肉瘤256256（W256W256） 33 筛选抗癌药物时，最好选用筛选抗癌药物时，最好选用3 3类瘤株，即肉瘤、类瘤株，即肉瘤、 腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中， 目前最受重视和应用最广的是：目前最受重视和应用最广的是： 小鼠小鼠LewisLewis肺癌肺癌 小鼠黑色素瘤小鼠黑色素瘤B16B16 小鼠白血病小鼠白血病P388P388 瘤株或细胞系的选择应尽量考虑与临床拟研瘤株或细胞系的选择应尽量考虑与临床拟研 究肿瘤的性质、部位等相近，如拟研究肝癌的究肿瘤的性质、部位等相近，如拟研究肝癌的 治疗，可首选肝癌瘤株。治

13、疗，可首选肝癌瘤株。 34 一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效，一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效， 如果仅选一种瘤株进行药物筛选就可能出现漏筛。如果仅选一种瘤株进行药物筛选就可能出现漏筛。 还必须指出，动物肿瘤的生物学特点与人类肿瘤还必须指出，动物肿瘤的生物学特点与人类肿瘤 有较大差别，对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对有较大差别，对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对 人类肿瘤未必有效。人类肿瘤未必有效。 35 ( (一一) )一般要求一般要求 整个操作应在整个操作应在无菌条件下无菌条件下进行，可在无菌室进行，可在无菌室 和超净工作台内操作。动物处死后消毒皮肤，对和超净工作台内操作。动

14、物处死后消毒皮肤，对 每个实体瘤应每个实体瘤应分别分别使用灭菌的外科器械切取，对使用灭菌的外科器械切取，对 腹水瘤则应腹水瘤则应分别分别用灭菌的注射器抽吸。用灭菌的注射器抽吸。 36 瘤块污染瘤块污染常是接种失败的主要原因，应特常是接种失败的主要原因，应特 别注意别注意!在高温季节操作时，可在盛有瘤源的在高温季节操作时，可在盛有瘤源的 器皿周围放置冰块直接降温。器皿周围放置冰块直接降温。 常用接种部位：常用接种部位： 实体瘤实体瘤_腋窝皮下腋窝皮下 肌肉接种肌肉接种_大腿肌肉大腿肌肉 腹水型肿瘤腹水型肿瘤_腹腔腹腔 37 （以以实体瘤实体瘤为例为例） - - 38 选取接种后选取接种后7 71

15、0d10d生长状态良好生长状态良好 的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。 切开皮肤，剥离出瘤块，置于平皿上切开皮肤，剥离出瘤块，置于平皿上, ,平皿应放置在平皿应放置在 冰块上冰块上, ,内置少许灭菌的内置少许灭菌的PBSPBS或其他营养液或其他营养液, ,剔除非剔除非 肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、 淡红色、鱼肉状的瘤组织，在无菌平皿内剪成淡红色、鱼肉状的瘤组织，在无菌平皿内剪成2 2mm3 3 的小块。的小块。 黑色素瘤则呈黑色或黑紫色黑色素瘤则呈黑色或黑紫色 注意不用瘤中央的

16、坏死部分注意不用瘤中央的坏死部分 39 - - 3 - 缩短接种操作时间缩短接种操作时间, ,从瘤块取材到接种完毕一般从瘤块取材到接种完毕一般 应在应在3030minmin内；平皿内放置少许灭菌内；平皿内放置少许灭菌PBSPBS或其他营养或其他营养 液；接种部位皮肤应先消毒。液；接种部位皮肤应先消毒。 40 (3)(3) 如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞 悬液接种悬液接种: : - - - 每只动物接种每只动物接种0.2ml；整个操作应在；整个操作应在30min内完成；每内完成；每 次抽吸前应将细胞混匀。次抽吸前应将细胞混匀。 41 (4)(

17、4) 对数生长细胞对数生长细胞胰酶消化胰酶消化PBSPBS洗涤洗涤2 2次次计计 数活细胞数数活细胞数用生理盐水稀释成细胞悬液用生理盐水稀释成细胞悬液细细 胞悬液置于冰上胞悬液置于冰上注射到接种部位注射到接种部位(0.2ml,(0.2ml,含含 1 110106 61 110107 7个细胞个细胞) )。 42 颈椎脱臼处死颈椎脱臼处死- - - 若用几只动物作为瘤源动物时若用几只动物作为瘤源动物时, ,应将腹水混合应将腹水混合. . 43 44 另取小量腹水另取小量腹水, ,置于加有肝素的干试管内置于加有肝素的干试管内, ,作为作为 观察细胞形态及细胞计数用。观察细胞形态及细胞计数用。 将空

18、针中剩余的腹水制备推片将空针中剩余的腹水制备推片, ,瑞氏染色瑞氏染色, ,镜下镜下 进行细胞分类计数进行细胞分类计数, ,其中瘤细胞数应其中瘤细胞数应95%95%。 抽出的腹水应为抽出的腹水应为乳白色乳白色浓稠液体浓稠液体, ,若为黄色或若为黄色或 含有大量红细胞时应弃去。含有大量红细胞时应弃去。 45 (2)细胞计数：细胞计数： 取肝素管内的瘤细胞取肝素管内的瘤细胞, ,用生理盐水稀释用生理盐水稀释1010倍倍; ;取稀释取稀释 液液0 0.9ml,.9ml,加加0 0.2%.2%台盼蓝生理盐水溶液台盼蓝生理盐水溶液0 0.1ml.1ml混匀。混匀。 用血细胞计数法计数瘤细胞总数和死细胞数

19、。用血细胞计数法计数瘤细胞总数和死细胞数。 瘤细胞死亡后，细胞膜通透性发生改变，细胞可瘤细胞死亡后，细胞膜通透性发生改变，细胞可 被台盼蓝染成蓝色被台盼蓝染成蓝色, , 而活细胞不着色。而活细胞不着色。 46 47 计数计数板四角大方格内的细胞数计数计数板四角大方格内的细胞数, , 计数时对计数时对 压边线的细胞压边线的细胞, ,计计左不计右左不计右, ,计计上不计下上不计下。计数四。计数四 个大方格内的细胞总数个大方格内的细胞总数, ,然后按下列公式计算总然后按下列公式计算总 细胞数和活细胞总数。细胞数和活细胞总数。 四大方格细胞总数死细胞数四大方格细胞总数死细胞数 活细胞数活细胞数/ml/

20、ml悬液悬液 稀释倍数稀释倍数1000010000 4 4 48 (3) 接种：接种： 腹水用含葡萄糖的无菌腹水用含葡萄糖的无菌HanksHanks液稀释至适当的液稀释至适当的 浓度浓度, , 每只鼠腹腔注入每只鼠腹腔注入0 0.1.10.2ml0.2ml。整个操作应。整个操作应 在在6060minmin内完成。内完成。 49 腹水型白血病如腹水型白血病如L1210L1210及及P388P388的接种方法同腹的接种方法同腹 水型肿瘤接种法。水型肿瘤接种法。 50 四、肿瘤细胞的冻存与复苏四、肿瘤细胞的冻存与复苏 为了使肿瘤细胞能得以长期使用，防止退化为了使肿瘤细胞能得以长期使用，防止退化 或变

21、异，保存不同代细胞的特征，对肿瘤细胞或或变异，保存不同代细胞的特征，对肿瘤细胞或 瘤株进行冷冻保存是很必要的。一般在液氮中冻瘤株进行冷冻保存是很必要的。一般在液氮中冻 存存1 12 2年，细胞存活率可达年，细胞存活率可达80%80%90%90%。 51 1.1.冻存方法冻存方法 取对数生长期增殖细胞，在冻存前一天最好取对数生长期增殖细胞，在冻存前一天最好 换一次培养液。经胰蛋白酶消化、离心、洗涤，换一次培养液。经胰蛋白酶消化、离心、洗涤， 用含用含7 7份份培养液、培养液、2 2份份小牛血清、小牛血清、1 1份份DMSODMSO配成配成 (1(15)5)10106 6个个/ml/ml的细胞悬液

22、，转入细胞冻存管，的细胞悬液，转入细胞冻存管， 贴上标签，注明细胞来源、名称及冻存日期。贴上标签，注明细胞来源、名称及冻存日期。 52 一般将冻存管一般将冻存管: : 4-30min4-30min；20-4h20-4h；70-70-过夜过夜-然然 后入液氮。后入液氮。 可将冻存管悬挂液氮罐口处过夜，之后浸入液可将冻存管悬挂液氮罐口处过夜，之后浸入液 氮中。氮中。 可用可用2cm2cm厚脱脂棉将冻存管严密包裹厚脱脂棉将冻存管严密包裹, ,2020 3030过夜，然后除去脱脂棉直接放入液氮中。过夜，然后除去脱脂棉直接放入液氮中。 53 2.2.冻存细胞的复苏方法冻存细胞的复苏方法 从液氮罐中取出冻

23、存管，迅速放入从液氮罐中取出冻存管，迅速放入38 38 4040水浴中，并不停摇动使其在水浴中，并不停摇动使其在1min1min内全部融内全部融 化，化，500500800r/min800r/min离心离心5min5min，弃上清，加入培，弃上清，加入培 养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液， 以后按常规培养。以后按常规培养。 54 细胞冻存及复苏的原则是细胞冻存及复苏的原则是“慢冻快融慢冻快融”，标标 准的冷冻速度是每分钟准的冷冻速度是每分钟1122，到，到7070 以下时可迅速放入液氮中。以下时可迅速放入液氮中。 所冻存的细胞必须是所冻存的细胞必须

24、是对数生长期对数生长期的细胞，细的细胞，细 胞密度应在胞密度应在10106 6个个/ml/ml以上。以上。 55 第四节第四节 人体肿瘤异种移植性肿瘤模型人体肿瘤异种移植性肿瘤模型 56 异种移植性肿瘤是移植性肿瘤的一种，近年很异种移植性肿瘤是移植性肿瘤的一种，近年很 重视人体肿瘤的动物体内移植模型。因为这种模重视人体肿瘤的动物体内移植模型。因为这种模 型使用人的肿瘤细胞，在组织形态和遗传特征等型使用人的肿瘤细胞，在组织形态和遗传特征等 方面，均与人类肿瘤相同，故用这种模型可以比方面，均与人类肿瘤相同，故用这种模型可以比 较直接研究人类肿瘤的生物学特性及抗肿瘤药物。较直接研究人类肿瘤的生物学特

25、性及抗肿瘤药物。 57 由于异种移植的移植排斥反应常可导致移植失由于异种移植的移植排斥反应常可导致移植失 败，故选择适合的受体动物是移植成功的关键。败，故选择适合的受体动物是移植成功的关键。 常用的宿主动物主要有常用的宿主动物主要有裸小鼠裸小鼠和和C57BL/6C57BL/6小鼠小鼠，也，也 可用免疫抑制剂或放射线等降低动物的免疫功能可用免疫抑制剂或放射线等降低动物的免疫功能 后，再进行移植。后，再进行移植。 58 一、裸小鼠作为移植宿主一、裸小鼠作为移植宿主 裸小鼠裸小鼠是在是在SPFSPF屏障系统内繁殖生长的屏障系统内繁殖生长的BALB/cBALB/c 裸小鼠，裸小鼠，6 68 8周龄，体

26、重周龄，体重212122g22g。 瘤源瘤源 人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类，人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类，一类一类是是 人的肿瘤细胞株人的肿瘤细胞株( (系系) )；另一类另一类是源于人体肿瘤组是源于人体肿瘤组 织块的癌细胞。织块的癌细胞。 常用人癌裸鼠移植的细胞株常用人癌裸鼠移植的细胞株(系系)、接种方式和、接种方式和 最佳生长期见教材。最佳生长期见教材。 59 二、免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主二、免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主 由于裸鼠娇弱，饲养条件要求高，费用昂贵，由于裸鼠娇弱，饲养条件要求高，费用昂贵， 故用裸鼠复制人体肿瘤异种移植肿瘤模型较难普故用裸鼠复制人体肿瘤异种移植肿

27、瘤模型较难普 遍应用。遍应用。 使用免疫功能受抑制的大鼠接种人癌细胞，可使用免疫功能受抑制的大鼠接种人癌细胞，可 获得人癌动物模型。获得人癌动物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，先皮下注射阿糖胞苷，2d2d后用后用10Gy 10Gy 60 60Co Co全身全身 照射。照射。 60 第五节第五节 抗肿瘤药物体内研究方法抗肿瘤药物体内研究方法 61 基本步骤是基本步骤是: : 低温保存瘤细胞低温保存瘤细胞速融速融加冷加冷 培养液洗除冻存液培养液洗除冻存液用培养液将肿瘤细胞调至一用培养液将肿瘤细胞调至一 定浓度定浓度给特定动物给特定动物 ( (宿主宿主) )注射注射 ( (ipip或或scsc) )。

28、肿瘤细胞在宿主动物体内增殖后肿瘤细胞在宿主动物体内增殖后取出取出给给 实验动物实验动物( (受体动物受体动物) )进行接种进行接种( (荷瘤动物荷瘤动物) )。 不同肿瘤的宿主动物、取用肿瘤的时间及接种方法见不同肿瘤的宿主动物、取用肿瘤的时间及接种方法见 表表4-14-1。 62 一、实体瘤一、实体瘤() 分组给药分组给药 接种次日将动物随机分组：接种次日将动物随机分组： 实验对照组实验对照组(C)(C)：接种肿瘤细胞不给受试药，：接种肿瘤细胞不给受试药， 只给受试药相应的溶剂只给受试药相应的溶剂 受试药组受试药组(T)(T)：设高、中、低：设高、中、低3 3个剂量个剂量 （给药（给药1 1次

29、次或或数次数次，给药途径应与推荐临床用药给药途径应与推荐临床用药 的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替）。的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替）。 阳性对照药：对瘤株活性高的已知抗肿瘤药阳性对照药：对瘤株活性高的已知抗肿瘤药 63 对对S180 , 艾氏腹水癌实体型艾氏腹水癌实体型 可用环磷酰可用环磷酰 胺胺20 30 mg /(kg .d) 对对L615 可用可用5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶25mg /(kg.d) 对其他腹水型肿瘤一般用丝裂霉素对其他腹水型肿瘤一般用丝裂霉素 2mg / (kg.d) 对对W256 可用丝裂霉素可用丝裂霉素4mg/ (kg.d)+环磷酰环磷酰 胺胺20 30mg

30、/(kg.d ) 64 疗效评价疗效评价 停药停药2424h h后处死动物后处死动物, ,称体重称体重, ,剥离瘤块剥离瘤块, , 称瘤称瘤 重。受试药物对实体瘤的疗效以重。受试药物对实体瘤的疗效以瘤重抑制率瘤重抑制率表示：表示： CT 瘤重抑制率瘤重抑制率 (%)= 100% C 式中式中T:T:受试药物组平均瘤重受试药物组平均瘤重; ; C:C:实验对照组实验对照组 ( (模型组模型组, ,荷瘤未用药动物荷瘤未用药动物) ) 平均瘤重。平均瘤重。 ( (瘤重抑制率瘤重抑制率%=%=(1 1T/C)T/C)100%100%计算）计算） 65 观察瘤重抑制率时，要求实验对照组小鼠观察瘤重抑制率

31、时，要求实验对照组小鼠 瘤重均值瘤重均值不得低于不得低于1g1g（大鼠瘤重均值不得低于（大鼠瘤重均值不得低于 2g2g），否则表示肿瘤生长不良，实验作废。），否则表示肿瘤生长不良，实验作废。 给药组动物平均体重下降（给药前后自身比给药组动物平均体重下降（给药前后自身比 较）不得超过较）不得超过15%15%，动物死亡数不得超过，动物死亡数不得超过20%20%，否，否 则表示受试药有毒性反应，应减少剂量重新实验。则表示受试药有毒性反应，应减少剂量重新实验。 66 若若中草药中草药瘤重抑制率大于瘤重抑制率大于30%30%，合成药合成药大于大于 40%40%，且与实验对照组比较具有统计学意义，重，且与

32、实验对照组比较具有统计学意义，重 复复3 3次，疗效均稳定，则评定该受试药具有一定次，疗效均稳定，则评定该受试药具有一定 抗肿瘤作用。抗肿瘤作用。 67 注意事项注意事项 实验中如果几个药给药组共用一个实验对照实验中如果几个药给药组共用一个实验对照 组时，后者的动物数应适当增加组时，后者的动物数应适当增加, ,公式为公式为: : C CG GM M。 式中式中C=C=实验对照组动物数；实验对照组动物数；G=G=同时试验的化同时试验的化 合物数或同时试验的药物数；合物数或同时试验的药物数；M=M=给药组的动物数。给药组的动物数。 如试验的药物数如试验的药物数G G为为2 2，各给药组，各给药组M

33、 M均为均为1010，故，故 C C2 21010，实验对照组的动物数为，实验对照组的动物数为2020。 68 二、腹水型肿瘤二、腹水型肿瘤() 分组给药分组给药 于接种后次日将动物随机分组并开始给药，于接种后次日将动物随机分组并开始给药， 受试药设高、中、低受试药设高、中、低3 3个剂量组，口服或腹腔注个剂量组，口服或腹腔注 射给药，连续给药射给药，连续给药5 51010次。次。 69 疗效评价疗效评价 接种后观察和记录动物接种后观察和记录动物死亡时间死亡时间和和生存天数生存天数。 实验对照组动物通常在实验对照组动物通常在2 23 3周内全部死亡。如实周内全部死亡。如实 验对照组中验对照组中

34、20%20%动物存活超过动物存活超过4 4周，表明肿瘤生周，表明肿瘤生 长不良，实验作废。长不良，实验作废。 如给药治疗期间实验对照组动物于如给药治疗期间实验对照组动物于7d7d内死亡内死亡 率率20%20%，表示肿瘤生长过快，实验失败。，表示肿瘤生长过快，实验失败。 70 腹水瘤以荷瘤动物的腹水瘤以荷瘤动物的生命延长时间生命延长时间作为疗作为疗 效指标，计算每组动物的平均存活时间，给药效指标，计算每组动物的平均存活时间，给药 组与实验对照组的平均生存天数之比组与实验对照组的平均生存天数之比(T/C)%(T/C)% 大于大于125%125%为有效。为有效。 在接种后在接种后60d60d分别记录

35、给药组和实验对照组动分别记录给药组和实验对照组动 物的平均生存时间物的平均生存时间( (如果生存超过如果生存超过60d60d，按，按60d60d计计 算算) )，按下列公式计算生命延长率：，按下列公式计算生命延长率： 71 式中式中: :T T为受试药物组平均生存天数；为受试药物组平均生存天数； C C为实验对照组平均生存天数。为实验对照组平均生存天数。 T C 生命延长率生命延长率( %) 100% C 72 若若腹腔注射给药时腹腔注射给药时生命延长率生命延长率75%75%，非腹腔非腹腔 注射给药注射给药生命延长率生命延长率50%50%，且与实验对照组比，且与实验对照组比 较具有统计学意义，

36、重复较具有统计学意义，重复3 3次，疗效稳定，则评次，疗效稳定，则评 定该受试药具有一定抗肿瘤作用。定该受试药具有一定抗肿瘤作用。 73 注意事项注意事项 1. 1.关于几个给药组共用一个实验对照组时关于几个给药组共用一个实验对照组时, ,实验实验 对照组的动物数，同实体瘤。对照组的动物数，同实体瘤。 2. 2.实验开始及结束时应分别称动物体重，若给实验开始及结束时应分别称动物体重，若给 药组动物体重明显低于实验对照组时药组动物体重明显低于实验对照组时( (如超过如超过15%)15%)， 判定疗效时应注意体重降低对肿瘤生长的影响，排判定疗效时应注意体重降低对肿瘤生长的影响，排 除非特异的毒性作

37、用。除非特异的毒性作用。 3. 3.腹水型肿瘤的研究方法腹水型肿瘤的研究方法, ,也适用于腹水型白血也适用于腹水型白血 病，如病，如L1210L1210及及P388P388。 74 三、移植性肿瘤研究方法的应用三、移植性肿瘤研究方法的应用 ( (一一) )肉瘤肉瘤S180S180模型（实体瘤）模型（实体瘤）( () ) 小鼠肉瘤小鼠肉瘤S180(sarcoma180)S180(sarcoma180)是经典的动物肿是经典的动物肿 瘤模型之一，在抗肿瘤药物体内筛选中被广泛应瘤模型之一，在抗肿瘤药物体内筛选中被广泛应 用。用。S180S180有实体型和腹水型两种生长形式，可以有实体型和腹水型两种生长

38、形式，可以 以一种形式传代，实体型与腹水型可互转。以一种形式传代，实体型与腹水型可互转。 75 操作步骤操作步骤 1.1. 取接种在昆明小鼠约取接种在昆明小鼠约7 71010d d的的S180S180肿瘤肿瘤 剔除肿瘤包膜和坏死部分剔除肿瘤包膜和坏死部分置于玻璃匀浆器内置于玻璃匀浆器内 加入生理盐水配制成含瘤细胞为加入生理盐水配制成含瘤细胞为 (1(12)2)10107 7/ml/ml单细胞悬液单细胞悬液 接种于同种异体接种于同种异体 小鼠腋窝皮下小鼠腋窝皮下, , 每只小鼠注射每只小鼠注射0.20.2ml(ml(含瘤细胞含瘤细胞 2 210106 6 4 4 10106 6个个) )。 76

39、 2.2.接种后第接种后第1 1d d 称体重、随机分组并开始给药称体重、随机分组并开始给药, , 包括包括: : 实验对照组实验对照组 阳性对照药组阳性对照药组 （环磷酰胺（环磷酰胺, ,接种次日接种次日1 1次性次性ip,100mg/kgip,100mg/kg） 受试药高剂量组受试药高剂量组 受试药中剂量组受试药中剂量组 受试药低剂量组受试药低剂量组 77 腹腔注射或灌胃给药腹腔注射或灌胃给药. . 给药方案有多种。给药方案有多种。 至接种后第至接种后第11111414d, d, 称量动物体重称量动物体重, , 解剖肿瘤解剖肿瘤 并称重。并称重。 78 结果计算结果计算 S180 S180

40、实体瘤生长速度与接种量成正比，一般实体瘤生长速度与接种量成正比，一般 重重2.5g2.5g的肿瘤需生长的肿瘤需生长8 811d11d。根据各组动物瘤重。根据各组动物瘤重 按前述公式计算按前述公式计算瘤重抑制率瘤重抑制率，并进行药物疗效评，并进行药物疗效评 定。定。 79 注意事项注意事项 1. 1. 本方法也适用于本方法也适用于B16B16、HepHep、W256W256和和C26C26等等 实体型移植性肿瘤模型。实体型移植性肿瘤模型。 2. 2. 实验结束时实验结束时, , 阳性对照组肿瘤基本不长阳性对照组肿瘤基本不长 或长得很小或长得很小, , 即阳性对照组的抑瘤率应大于即阳性对照组的抑瘤

41、率应大于80%80% 以上以上, , 而实验对照组动物在此期间瘤重应在而实验对照组动物在此期间瘤重应在2 2g g 左右。左右。 80 3.3.受试药组动物体重不低于原始体重的受试药组动物体重不低于原始体重的20%,20%, 否则表示受试药剂量过高否则表示受试药剂量过高, , 需降低剂量重试。需降低剂量重试。 4. 4.腋窝部皮肤松弛，皮下接种后能允许肿瘤腋窝部皮肤松弛，皮下接种后能允许肿瘤 生长得较大，也可接种于腹股沟部皮下。生长得较大，也可接种于腹股沟部皮下。 81 黑色素瘤 82 83 模型组模型组 阳性药组阳性药组 给药组给药组 84 ( (二二) )大鼠大鼠W256W256癌肉瘤模型

42、癌肉瘤模型( () ) 瓦克癌肉瘤瓦克癌肉瘤256256（Walker256Walker256，简称，简称W256W256）的生）的生 长有实体型和腹水型两种形式，并可互转。接种长有实体型和腹水型两种形式，并可互转。接种 在皮下或肌肉内成为实体瘤在皮下或肌肉内成为实体瘤, , 接种在腹腔则成为接种在腹腔则成为 腹水瘤。在接种后开始给药治疗腹水瘤。在接种后开始给药治疗, , 实验结束后比实验结束后比 较对照组与试验组的瘤重或大鼠平均存活时间较对照组与试验组的瘤重或大鼠平均存活时间, , 可判断受试药物的疗效。可判断受试药物的疗效。 85 操作步骤操作步骤 1.1.取接种于大鼠大腿肌肉或腹腔第取接

43、种于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d7d、接种于、接种于 皮下皮下111113d13d的的W256W256瘤瘤, , 配制成瘤细胞悬液配制成瘤细胞悬液 ( (约约 2 210106 6 4 4 10106 6个瘤细胞个瘤细胞) )。取体重。取体重555565g Wistar65g Wistar 大鼠大鼠, , 雌雄不限雌雄不限, , 每次实验均用同一性别。每鼠每次实验均用同一性别。每鼠 大腿肌内接种瘤细胞悬液大腿肌内接种瘤细胞悬液0.2ml, 0.2ml, 每组用每组用6 61010只动只动 物。物。 86 2.2.接种后第接种后第1d1d称动物体重称动物体重, , 随机分组并开始随机分组并开始 给药

44、给药, ,均用腹腔注射均用腹腔注射, ,每天每天1 1次次, , 连续连续7 710d,10d,至第至第 8 811d11d处死动物处死动物, , 将双侧后肢从髋关节外剪下将双侧后肢从髋关节外剪下, , 分别称重分别称重, ,荷瘤肢体重减去对侧正常肢体重即为荷瘤肢体重减去对侧正常肢体重即为 瘤重。瘤重。 87 结果计算结果计算 按前述公式计算瘤重抑制率。按前述公式计算瘤重抑制率。 注意事项注意事项 1.1.本方法也适用于本方法也适用于S180S180及艾氏腹水瘤等肿瘤。及艾氏腹水瘤等肿瘤。 2.2.接种的瘤源有两种接种的瘤源有两种；用腹水型瘤源用腹水型瘤源, , 传代传代 6 68d 8d 的

45、瘤源的瘤源( (抽出的腹水为血性抽出的腹水为血性););用皮下接种的瘤用皮下接种的瘤, , 用匀浆法制成瘤细胞悬液。用匀浆法制成瘤细胞悬液。 88 3.3.对照组肌肉型平均瘤重在对照组肌肉型平均瘤重在3 35g; 5g; 皮下肿瘤皮下肿瘤 平均瘤重为平均瘤重为3 312g; 12g; 腹水型动物平均生存腹水型动物平均生存101014d14d。 4. 4.第第7d 7d 给药组动物存活率应大于给药组动物存活率应大于65%, 65%, 否则否则 表明所试药物剂量过大。表明所试药物剂量过大。 89 ( (三三)Lewis)Lewis肺癌模型肺癌模型( () ) 19511951年年LewisLewi

46、s在未经过处理的在未经过处理的C57BLC57BL小鼠肺发小鼠肺发 现了未分化上皮样肿瘤，此后建立了实体型移现了未分化上皮样肿瘤，此后建立了实体型移 植性肿瘤模型。植性肿瘤模型。 90 操作步骤操作步骤 1.1.取取C57BL/6C57BL/6小鼠皮下接种小鼠皮下接种8 812d12d的的LewisLewis肺肺 癌作为瘤源，无菌条件下剥离瘤组织，用剪刀癌作为瘤源，无菌条件下剥离瘤组织，用剪刀 剪成小块，用套管针移植或用玻璃匀浆器加无剪成小块，用套管针移植或用玻璃匀浆器加无 菌生理盐水菌生理盐水(1:3)(1:3)研磨成匀浆，过研磨成匀浆，过400400目丝网，目丝网， 成单细胞悬液，计数每毫

47、升匀浆液中的瘤细胞成单细胞悬液，计数每毫升匀浆液中的瘤细胞 数。数。 2.2.给每只成年给每只成年C57BL/6C57BL/6小鼠腋窝皮下接种小鼠腋窝皮下接种 2 210106 6个细胞（个细胞（0.2ml/0.2ml/只）。只）。 91 3.3.接种后第接种后第1 1天进行动物分组并给药，阳性天进行动物分组并给药，阳性 对照药用环磷酰胺对照药用环磷酰胺50mg/kg50mg/kg体重体重(0.2ml/10g(0.2ml/10g体体 重重),),隔日灌胃给药，共给隔日灌胃给药，共给3 3次。给药组每天灌次。给药组每天灌 胃给予受试药胃给予受试药1 1次，实验对照组给予等体积生次，实验对照组给予

48、等体积生 理盐水，连续理盐水，连续10d10d。 4.4.末次给药后末次给药后24h24h处死动物，称体重，剥离处死动物，称体重，剥离 腋窝下肿瘤并称重，计算瘤重生长抑制率。腋窝下肿瘤并称重，计算瘤重生长抑制率。 92 皮下移植皮下移植Lewis肺癌的肺癌的C57BL/6小鼠小鼠 93 Lewis肺癌移植瘤肺癌移植瘤 94 模型评价模型评价 Lewis Lewis肺癌恶性程度较高，受体鼠为肺癌恶性程度较高，受体鼠为C57BL/6C57BL/6 小鼠，是目前国际应用较普遍的移植肿瘤模型小鼠，是目前国际应用较普遍的移植肿瘤模型 之一，由于其接种部位的不同，用途比较广泛。之一，由于其接种部位的不同，

49、用途比较广泛。 本方法是评价药物体内抗肿瘤作用最常用的方本方法是评价药物体内抗肿瘤作用最常用的方 法，对药物作用的预测性很好。法，对药物作用的预测性很好。 95 注意事项注意事项 1. 1.实验开始和实验结束时应分别称量动物实验开始和实验结束时应分别称量动物 体重，如果给药组动物体重明显低于实验对照体重，如果给药组动物体重明显低于实验对照 组（超过组（超过15%15%），判定药物疗效时应注意体重），判定药物疗效时应注意体重 降低对肿瘤生长的影响，排除非特异的毒性作降低对肿瘤生长的影响，排除非特异的毒性作 用。用。 2.2.肿瘤接种后肿瘤接种后2 2周，单个鼠瘤重应在周，单个鼠瘤重应在500 m

50、g500 mg 以上，否则说明肿瘤生长不良，肿瘤接种失败。以上，否则说明肿瘤生长不良，肿瘤接种失败。 96 3.3.对某些效价较低的药物，如未纯化中草药对某些效价较低的药物，如未纯化中草药 有效成分或多糖类的筛选，可将瘤细胞接种于后有效成分或多糖类的筛选，可将瘤细胞接种于后 肢肢爪垫爪垫皮下，接种细胞数为皮下，接种细胞数为(2(24)4)10105 5/0.02ml/0.02ml （细胞数仅为常规皮下接种量的（细胞数仅为常规皮下接种量的1/31/3），接种后），接种后 给药治疗，给药治疗，10d10d后从踝关节处切除带瘤的足称重，后从踝关节处切除带瘤的足称重， 计算瘤重抑制率。若切除带瘤的足后

51、继续给药，计算瘤重抑制率。若切除带瘤的足后继续给药， 还可观察受试药对肺转移的疗效。还可观察受试药对肺转移的疗效。 97 ( (四四)L1210)L1210白血病小鼠模型白血病小鼠模型( () ) L1210 L1210白血病最早是用甲基胆蒽在白血病最早是用甲基胆蒽在DBA/2DBA/2小鼠小鼠 诱发的，能在诱发的，能在DBA/2DBA/2小鼠及其杂交一代小鼠及其杂交一代BDF1BDF1和和 CDF1CDF1小鼠体内生长。小鼠白血病小鼠体内生长。小鼠白血病L1210L1210为腹水型为腹水型 肿瘤，是最常用的移植性肿瘤模型。肿瘤，是最常用的移植性肿瘤模型。 将将1 110105 5个腹水瘤细胞

52、接种在个腹水瘤细胞接种在DBA/2DBA/2、BDF1BDF1或或 CDF1CDF1小鼠腹腔内，接种后小鼠腹腔内，接种后24 h24 h开始给药治疗，实开始给药治疗，实 验结束后比较给药组与实验对照组小鼠的平均存验结束后比较给药组与实验对照组小鼠的平均存 活时间，可判断药物的疗效。活时间，可判断药物的疗效。 98 操作方法操作方法 1. 1.取接种于取接种于DBA/2DBA/2小鼠约小鼠约7d7d的的L1210L1210腹水，用腹水，用 生理盐水配成瘤细胞数为生理盐水配成瘤细胞数为10106 6个个/ml/ml的细胞悬液，的细胞悬液， 接种于接种于BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠腹腔内

53、，每只小鼠接种小鼠腹腔内，每只小鼠接种 0.1ml0.1ml（含瘤细胞（含瘤细胞1 110105 5个）。个）。 99 2.2.实验当天接种动物，将瘤株进行细菌培养。实验当天接种动物，将瘤株进行细菌培养。 接种后第接种后第1 1天检查培养情况，如无污染，将称量动天检查培养情况，如无污染，将称量动 物体重并随机分组后开始给药。接种后第物体重并随机分组后开始给药。接种后第2 2天再检天再检 查培养情况，如有污染，则实验报废。查培养情况，如有污染，则实验报废。 动物分组包括实验对照组、受试药组及阳性对动物分组包括实验对照组、受试药组及阳性对 照药，均腹腔注射给药。给药方案有多种。第照药，均腹腔注射给

54、药。给药方案有多种。第2020 天如果除阳性对照药组及受试药组外再无其他动天如果除阳性对照药组及受试药组外再无其他动 物存活，则终止实验，评价结果。第物存活，则终止实验，评价结果。第3030天处死全天处死全 部动物，并评价受试药的疗效。部动物，并评价受试药的疗效。 100 结果结果 小鼠接种小鼠接种L1210L1210后平均存活后平均存活8 811d11d。一般观察。一般观察 30d30d，根据各组动物的平均存活天数，按公式计，根据各组动物的平均存活天数，按公式计 算受试药对算受试药对L1210L1210白血病小鼠的生命延长率（未白血病小鼠的生命延长率（未 死亡动物按死亡动物按30d30d计）

55、。计）。 101 注意事项注意事项 1. 1.本方法也适用于本方法也适用于P388P388、EACEAC、HepHep、W256W256和和 S180S180等腹水型移植性肿瘤模型。等腹水型移植性肿瘤模型。 2. 2.如瘤株培养证明被污染，需重新接种动物。如瘤株培养证明被污染，需重新接种动物。 3.3.接种后第接种后第5 5天给药组动物存活率应大于天给药组动物存活率应大于65%65%， 否则说明药物剂量过大或药物有毒性。否则说明药物剂量过大或药物有毒性。 4. 4.如实验对照组动物在如实验对照组动物在18d18d内仍未死亡，则认内仍未死亡，则认 为肿瘤生长不良，接种失败，应分析原因重新实为肿瘤

56、生长不良，接种失败，应分析原因重新实 验。验。 102 ( (五五) )小鼠肾包膜下肿瘤移植模型小鼠肾包膜下肿瘤移植模型( () ) 在裸鼠、在裸鼠、BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠的肾包膜（肾纤维小鼠的肾包膜（肾纤维 膜）下移植人的瘤细胞，由于移植的瘤块仅膜）下移植人的瘤细胞，由于移植的瘤块仅1mm1mm3 3， 可由肾包膜下丰富的血管供给营养和氧，瘤块能可由肾包膜下丰富的血管供给营养和氧，瘤块能 迅速增长，短期内迅速增长，短期内(6(611d)11d)肿瘤生长较规则，接肿瘤生长较规则，接 种成活率接近种成活率接近100%100%。 103 操作方法操作方法 小鼠肾包膜下异种移植的肿

57、瘤多选用人癌，小鼠肾包膜下异种移植的肿瘤多选用人癌， 其来源于裸鼠皮下接种传代其来源于裸鼠皮下接种传代161622d22d的人癌瘤株、的人癌瘤株、 人癌培养细胞株或手术切除的新鲜癌组织。人癌培养细胞株或手术切除的新鲜癌组织。 104 1.1.在无菌操作下取小鼠或人体瘤组织，剪去包在无菌操作下取小鼠或人体瘤组织，剪去包 膜及出血坏死部分，切成约膜及出血坏死部分，切成约1mm1mm3 3小块。选用体重小块。选用体重 181822g22g裸鼠、裸鼠、BDF1BDF1或或CDF1CDF1小鼠，麻醉后手术区消小鼠，麻醉后手术区消 毒，打开腹腔暴露左肾，将毒，打开腹腔暴露左肾，将1 1小块瘤组织装入套管小

58、块瘤组织装入套管 针内，移植于肾外侧中线处的包膜下。针内，移植于肾外侧中线处的包膜下。 105 2.2.在装有显微尺的体视显微镜下，测量起始移植在装有显微尺的体视显微镜下，测量起始移植 块的长径块的长径(a)(a)和短径和短径(b)(b)，测量后关闭腹部切口。，测量后关闭腹部切口。 如在肾包膜下注射培养的瘤细胞株，则注射含如在肾包膜下注射培养的瘤细胞株，则注射含 1 110107 7个细胞的悬液个细胞的悬液0.02 ml0.02 ml，不必测量移植瘤块，不必测量移植瘤块 的长短径。的长短径。 106 3.3.接种次日分组、给药，每天给药接种次日分组、给药，每天给药1 1次，共次，共 5 510

59、d10d。停药次日，即。停药次日，即BDF1BDF1小鼠接种后小鼠接种后6d6d或裸鼠或裸鼠 接种后接种后11d11d，称量体重，解剖带瘤肾脏，在体视，称量体重，解剖带瘤肾脏，在体视 显微镜下测量瘤块的长径显微镜下测量瘤块的长径(a)(a)和短径和短径(b)(b)，按，按 abab2 2/2/2公式计算瘤体积公式计算瘤体积(V)(V)。 4.4.肿瘤体积肿瘤体积(V)(V)也可以用下式计算：也可以用下式计算：V V (4/3)abc(4/3)abc(1/6)ABC(1/6)ABC，其中，其中为圆周率，为圆周率， ABCABC为肿瘤相互垂直的为肿瘤相互垂直的3 3个直径，个直径，abcabc为肿瘤相为肿瘤相 互垂直的互垂