第五章DNA的分子结构下.

1、一、一、DNADNA的一级结构及序列测定的一级结构及序列测定 二、二、 DNADNA的二级结构的二级结构双螺旋结构模型双螺旋结构模型 三、三、 DNADNA的三级结构的三级结构 四、四、DNADNA的变性与复性的变性与复性 五、五、 DNADNA的顺序组织的顺序组织 第五章第五章 DNADNA的结构的结构 四、四、DNADNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交 1.1.变性变性 2.2.复性复性 3.3.分子杂交分子杂交 在一定条件下，在一定条件下，DNADNA双螺旋可以彻底地解链，分离双螺旋可以彻底地解链，分离 成两条互补的单链，这种现象称为成两条互补的单链，这种现象称为DNADN

2、A变性。变性。 (1)(1)DNADNA的熔解曲线和熔解温度的熔解曲线和熔解温度 由核酸变性而引起紫外吸收增加的现象，称为由核酸变性而引起紫外吸收增加的现象，称为增色增色 效应。效应。 吸收值变化对吸收值变化对DNADNA溶液温度的曲线称为溶液温度的曲线称为熔解曲线熔解曲线。 增色效应达到最大值的增色效应达到最大值的50%50%时的温度为熔解温度时的温度为熔解温度TmTm 值值。 1.1.变性变性( (denaturationdenaturation) ) DNADNA变性（变性（加热或极端加热或极端pHpH） (2)(2)影响影响TmTm的因素的因素 DNADNA的碱基组成的碱基组成 在在S

3、SCSSC溶液中（溶液中（0.150.15mol/mol/LNaClLNaCl，0.015 mol/L0.015 mol/L柠檬酸柠檬酸 钠，钠，pH 7.0pH 7.0），），经验公式经验公式 （G+C)%=(Tm-69.3) G+C)%=(Tm-69.3) 2.44 2.44 式中式中69.369.3是无是无G-CG-C对存在时的对存在时的TmTm。 溶液的离子强度溶液的离子强度 在不同盐浓度的同一种在不同盐浓度的同一种DNA热溶液中，热溶液中， Tm随盐浓度增加而增高，而且变性过程跨随盐浓度增加而增高，而且变性过程跨 越的温度范围更狭窄，也就是盐溶液浓度越的温度范围更狭窄，也就是盐溶液浓

4、度 越大，变性越困难。在纯水中，双链互相越大，变性越困难。在纯水中，双链互相 排斥，排斥，DNA在室温下就会变性。在室温下就会变性。 溶液的溶液的pHpH 溶液在溶液在pH 5-9的范围内改变时，的范围内改变时，Tm变化不明显，变化不明显， pH低于低于5.0时，时，DNA不稳定，易脱嘌呤。更酸的条不稳定，易脱嘌呤。更酸的条 件使碱基广泛质子化；高件使碱基广泛质子化；高pH条件下碱基广泛去质子，条件下碱基广泛去质子， 氢键破坏，当氢键破坏，当pH11.3时，所有氢键均不存在，时，所有氢键均不存在， DNA完全变性。完全变性。 实践中，常利用碱处理方法来制备变性实践中，常利用碱处理方法来制备变性

5、DNA以避以避 免在高温条件下一些磷酸二酯键断裂造成降解的变免在高温条件下一些磷酸二酯键断裂造成降解的变 性产物。性产物。 变性剂：能降低变性剂：能降低TmTm值值 DNA变性剂变性剂 变性剂变性剂 甲醇甲醇 乙醇乙醇 甲酰胺甲酰胺 脲脲 二甲基二甲基 甲酰胺甲酰胺 氨基甲氨基甲 酸甲酯酸甲酯 浓度浓度mol/L 3.5 1.2 1.9 1.0 0.6 0.5 实际工作中常在实际工作中常在DNA溶液中加入甲酰胺来降低溶液中加入甲酰胺来降低Tm 值，这样不仅使值，这样不仅使DNA免受高温破坏，而且易于操作。免受高温破坏，而且易于操作。 通常用通常用50%甲酰胺可以使甲酰胺可以使Tm降低降低30。

6、 螺旋松弛蛋白螺旋松弛蛋白 生物体内不可能有高浓度的小分子变性生物体内不可能有高浓度的小分子变性 剂，而大分子物质溶解度比较小，相应限剂，而大分子物质溶解度比较小，相应限 制了它们的变性效率；然而生物体内有些制了它们的变性效率；然而生物体内有些 蛋白质可结合到蛋白质可结合到DNA链上引发链上引发DNA变性。变性。 T4噬菌体基因噬菌体基因32编码一个在编码一个在T4 DNA复制时必要的复制时必要的 DNA 结合蛋白，称为结合蛋白，称为32蛋白。这种蛋白引起蛋白。这种蛋白引起DNA双双 链局部解旋而促进复制的进行。链局部解旋而促进复制的进行。 2.2.复性复性( (renaturationren

7、aturation) ) 变性分离的变性分离的DNADNA两条互补链，在适当条件下重新两条互补链，在适当条件下重新 缔合形成双螺旋的过程称为复性或退火。缔合形成双螺旋的过程称为复性或退火。 复性是一个缓慢的过程，因为在溶液中，互补的复性是一个缓慢的过程，因为在溶液中，互补的 单链首先必须找到对方，然后以合适的取向形成碱单链首先必须找到对方，然后以合适的取向形成碱 基对。一旦形成一个短的一段双螺旋基对。一旦形成一个短的一段双螺旋DNADNA区，其余区，其余 的的DNADNA通过紧扣机制（通过紧扣机制（Zippering mechanismZippering mechanism）可以可以 快速复性

8、。核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸快速复性。核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸 复性而引起紫外吸收降低的现象，称为复性而引起紫外吸收降低的现象，称为减色效应减色效应 。 DNADNA复性复性 影响复性速度的因素影响复性速度的因素 复性动力学曲线（复性动力学曲线（Cot曲线）曲线） 2. 2. 复复 性性 影响复性速度的因素影响复性速度的因素 复性的最适温度：比复性的最适温度：比DNA的的Tm低低25 的温度。的温度。 （1）DNA顺序的复杂性：复杂性越高，顺序的复杂性：复杂性越高，DNA复性复性 速度越慢。速度越慢。 （2）DNA浓度：浓度：DNA浓度越大，复性越快。浓度越大，复性越快。 （

9、3）DNA片段大小：片段大小：DNA片段越大，复性越慢，片段越大，复性越慢， 一般在实验中将一般在实验中将DNA切成切成400bp大小的片段进行复大小的片段进行复 性。性。 （4）温度：在一定的温度范围内，温度高一些，有）温度：在一定的温度范围内，温度高一些，有 利于复性，温度较低时，利于复性，温度较低时，DNA链间少数错配碱基难链间少数错配碱基难 以解开再重新进行正确配对。以解开再重新进行正确配对。 （5）离子强度：复性必须在有一定离子强度的溶液）离子强度：复性必须在有一定离子强度的溶液 内进行，以降低内进行，以降低DNA链间由于磷酸基的负电荷造成链间由于磷酸基的负电荷造成 的斥力。常用的斥

10、力。常用0.150.5mol/L的的NaCl溶液。溶液。 复性动力学曲线（复性动力学曲线（Cot曲线）曲线） DNA复性是一种双分子二级反应：复性是一种双分子二级反应： S + SD 单链消失的速度可用下面公式表示：单链消失的速度可用下面公式表示： dC dt =kC2 _ k是缔合反应速度常数，是缔合反应速度常数，C是时间是时间t时单链时单链DNA浓度，当浓度，当t=0时，时， C=C0，表明所有的表明所有的DNA都是单链，都是单链， C0为为DNA总浓度，时间总浓度，时间t 时剩下的单链时剩下的单链DNA的量可表示为：的量可表示为： dC dt =kC2 _ t=0，C=C0 积分积分 C

11、 C0 = 1+kC0t 1 当反应完成一半，即半复性时，当反应完成一半，即半复性时， C C0 = 0.5 t=t1/2 C0t1/2 = 1/k 任何特定任何特定DNA的复性都可用的复性都可用C0t1/2 表示，单位是表示，单位是 核苷酸核苷酸mol.秒秒/L。通常用通常用C0t1/2 来描述基因组的复来描述基因组的复 性特征。性特征。 C0t1/2值与基因组中值与基因组中DNA含量直接相关，含量直接相关， DNA总量一定时，复性反应的总量一定时，复性反应的C0t1/2与反应体系中与反应体系中 DNA的复杂性成正比。基因组越复杂，任何特定的复杂性成正比。基因组越复杂，任何特定 顺序的拷贝数

12、就越少，复性越慢。顺序的拷贝数就越少，复性越慢。 基因组的复杂性是用基因组的复杂性是用DNA中单一序列的长度加上中单一序列的长度加上 各个重复序列的长度来表示。复杂性的单位是核苷酸各个重复序列的长度来表示。复杂性的单位是核苷酸 对的数目。如某一基因组含序列对的数目。如某一基因组含序列a、b、c、d而无重复而无重复 序列，则其复杂性即为序列，则其复杂性即为a+b+c+d。这时复杂性即与分这时复杂性即与分 子量相同。高等生物的子量相同。高等生物的DNA ，除单一序列外，还常含除单一序列外，还常含 重复序列，例如，某一生物的重复序列，例如，某一生物的DNA由由106拷贝的拷贝的a ， 103拷贝的拷

13、贝的b ，10拷贝的拷贝的c ，1拷贝的拷贝的d和和e组成，其复杂组成，其复杂 性为性为a+b+c+d+e ，这时，这时DNA的复杂性就远远小于其分的复杂性就远远小于其分 子量。子量。 以以C0t的对数为横坐标以的对数为横坐标以 或或1- 为纵坐标为纵坐标 C C0 C C0 可作图得可作图得DNA C0t曲线曲线 任何基因组或部分基因组任何基因组或部分基因组DNA的复杂性可以通过的复杂性可以通过 把它们的把它们的C0t1/2与已知复杂性的标准与已知复杂性的标准DNA进行比较得进行比较得 知。常以知。常以E.coli DNA作为标准，它的复杂性相当于作为标准，它的复杂性相当于 整个基因组的长度

14、（整个基因组的长度（ E.coli基因组基因组4.2 106bp，按按 所有顺序均不重复计算）。这个关系式为：所有顺序均不重复计算）。这个关系式为： C0t1/2（某基因组某基因组DNA） C0t1/2（大肠杆菌大肠杆菌DNA） 复杂性（基因组复杂性（基因组DNA） 4.2 106bp = 对于大部分原核生物进行复性动力学分析都可对于大部分原核生物进行复性动力学分析都可 以得到单相以得到单相C0t曲线，复杂性可以直接以基因组大曲线，复杂性可以直接以基因组大 小来表示。用复性动力学对真核生物基因组作分小来表示。用复性动力学对真核生物基因组作分 析时，曲线就复杂了，通常反应的析时，曲线就复杂了，通

15、常反应的C0t值跨越值跨越8个个 对数量的值，因为它是由几个动力学纯的单个复对数量的值，因为它是由几个动力学纯的单个复 性组分组成的，每个组分有自己的特征复性动力性组分组成的，每个组分有自己的特征复性动力 学。根据这种学。根据这种C0t曲线可以计算出在该真核生物基曲线可以计算出在该真核生物基 因组中各种类别重复因组中各种类别重复DNA的比例及其拷贝数。的比例及其拷贝数。 0 25 50 75 100 复复 性性 百百 分分 数数 1-C/C0 10-410-11021031010-2110410-3 C0t 快组分占总快组分占总DNA的的25% ，C0t1/2=0.0013 中组分占总中组分占

16、总DNA的的30% ，C0t1/2=1.9 慢组分占总慢组分占总DNA的的45% ，C0t1/2=630 当把各组分作为纯的组分来考虑时，各组当把各组分作为纯的组分来考虑时，各组 分的分的C0t1/2分别为：分别为： 慢组分占总慢组分占总DNA的的45% ，在复性反应中它的，在复性反应中它的 浓度是浓度是0.45C0，C0t1/2= 0.45 630 =283.5 中组分：中组分：C0t1/2=0.30 1.9=0.57 快组分：快组分：C0t1/2=0.25 0.0013=3.25 10-4 对每个组分进行单独的动力学处理，与标准对每个组分进行单独的动力学处理，与标准 DNA比较可以分别计算

17、出它们的复杂性。如果比较可以分别计算出它们的复杂性。如果 在同样条件下，在同样条件下，E.coli的的 DNA复性复性 C0t1/2=4.0， 则各组分的复杂性分别为：则各组分的复杂性分别为： 慢组分：慢组分： 283.5 4 4.2 106bp = 3.0 108bp 0.57 4 4.2 106bp = 6 105bp 3.25x10-4 4 4.2 106bp = 340bp 中组分：中组分： 快组分：快组分： 一般认为慢组分就是非重复序列，在基因组中以一般认为慢组分就是非重复序列，在基因组中以 单拷贝存在，可以用它的单拷贝存在，可以用它的DNA复杂性来确定整复杂性来确定整 个基因组的大

18、小。个基因组的大小。 整个基因组的大小为：整个基因组的大小为：X . 45%=3.0 108bp X=6.67 108bp 则其他各组分的含量及拷贝数为：则其他各组分的含量及拷贝数为： 中组分中组分 6.67 108bp . 30%= 2.0 108bp 2.0 108bp / 6 105bp=333 快组分快组分 6.67 108bp . 25%= 1.67 108bp 1.67 108bp / 340=50万万 3.3.分子杂交分子杂交( (hybridization)hybridization) 在退火条件下，不同来源的互补在退火条件下，不同来源的互补DNADNA单链互相配对单链互相配对

19、 形成形成DNADNA双链，或者双链，或者DNADNA单链和互补的单链和互补的RNARNA链互相配对链互相配对 形成形成DNA-RNADNA-RNA杂交双链的过程就是分子杂交。制备特杂交双链的过程就是分子杂交。制备特 定的探针（定的探针（probeprobe）通过杂交技术可进行基因的检测通过杂交技术可进行基因的检测 和定位研究。实例：和定位研究。实例：southernsouthern印迹法印迹法 核核 酸酸 的的 杂杂 交交 Southern 印迹法印迹法 DNA分子分子 限制片段限制片段 限制性酶切割限制性酶切割 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记与

20、放射性标记 DNA探针杂交探针杂交 放射自显影放射自显影 带有带有DNA片片 段的凝胶段的凝胶 凝胶凝胶 滤膜滤膜 用缓冲液用缓冲液 转移转移DNA 吸附有吸附有DNA 片段的膜片段的膜 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究 中具有重要意义，应用分子杂交的基本原理中具有重要意义，应用分子杂交的基本原理 发展了不少新技术和新方法，它们广泛应用发展了不少新技术和新方法，它们广泛应用 于测定基因在基因组中的拷贝数，确定基因于测定基因在基因组中的拷贝数，确定基因 和它的转录物和它的转录物RNARNA之间的关系，构建基因组基之间的关系，构建基因组基 因图谱，确定不同生

21、物之间的遗传和进化关因图谱，确定不同生物之间的遗传和进化关 系等。系等。 一、一、DNADNA的一级结构及序列测定的一级结构及序列测定 二、二、 DNADNA的二级结构的二级结构双螺旋结构模型双螺旋结构模型 三、三、 DNADNA的三级结构的三级结构 四、四、DNADNA的变性与复性的变性与复性 五、五、 DNADNA的顺序组织的顺序组织 第五章第五章 DNADNA的结构的结构 五、五、DNADNA的顺序组织的顺序组织 DNA分子中不同的区域有不同的功能，有些分子中不同的区域有不同的功能，有些 区域是编码蛋白质的结构基因，有些包含了复区域是编码蛋白质的结构基因，有些包含了复 制、转录或翻译等调

22、控信号。制、转录或翻译等调控信号。具有不同功能的具有不同功能的 DNA区域在整个分子中的分布情况就是区域在整个分子中的分布情况就是DNA顺顺 序组织序组织所要讨论的主题。所要讨论的主题。 （一）原核生物（一）原核生物DNA顺序组织顺序组织 1. 噬菌体噬菌体X174和和G4 E.coli噬菌体噬菌体X174和和G4都是小球形病毒都是小球形病毒DNA 为单链环状，从为单链环状，从DNA顺序组织的角度比较，二顺序组织的角度比较，二 者有以下几个特点：者有以下几个特点： （1） X174和和G4都编码了都编码了11个蛋白质，但只转个蛋白质，但只转 录成三个录成三个mRNA。每个每个mRNA包含了多个

23、顺反包含了多个顺反 子，而且功能上相关的顺反子通常串联在一个子，而且功能上相关的顺反子通常串联在一个 mRNA分子上。这种分子上。这种DNA顺序组织的方式可能顺序组织的方式可能 是使这些基因协同表达的一种调控方式。是使这些基因协同表达的一种调控方式。 （2） X174和和G4 DNA分子的绝大部分是用来编码分子的绝大部分是用来编码 蛋白质的（蛋白质的（95%），只有一小部分不翻译出来。染色），只有一小部分不翻译出来。染色 体的绝大部分用来编码蛋白质，这也是原核生物体的绝大部分用来编码蛋白质，这也是原核生物DNA 顺序组织的一个特点。不翻译出来的顺序组织的一个特点。不翻译出来的DNA区域，或称区

24、域，或称 间隔区，经常包含了一些控制基因表达的间隔区，经常包含了一些控制基因表达的DNA顺序。顺序。 （3） X174和和G4 在在DNA顺序组织上最大的特点是顺序组织上最大的特点是 基因重叠。其它一些病毒，如猿猴病毒（基因重叠。其它一些病毒，如猿猴病毒（SV40） DNA中也发现有基因重叠现象。一般而言，这一类病中也发现有基因重叠现象。一般而言，这一类病 毒毒DNA分子都不大，但又必须装入相当多的基因，可分子都不大，但又必须装入相当多的基因，可 能这种压力导致病毒能这种压力导致病毒DNA在进化过程中重叠起来。由在进化过程中重叠起来。由 于基因的重叠，在重叠部位一个碱基的突变将影响二于基因的重

25、叠，在重叠部位一个碱基的突变将影响二 个甚至三个蛋白质。个甚至三个蛋白质。 基因重叠的方式提供了一个经济地利用基因重叠的方式提供了一个经济地利用DNA顺序顺序 的方法。同时，也使基因组的可变性变小，至今完的方法。同时，也使基因组的可变性变小，至今完 全重叠的基因仅在噬菌体和病毒中发现，至于几个全重叠的基因仅在噬菌体和病毒中发现，至于几个 核苷酸的交叉重叠在细菌多顺反子核苷酸的交叉重叠在细菌多顺反子mRNA中也有发中也有发 现，常表现为一个编码区的终止和另一个编码区的现，常表现为一个编码区的终止和另一个编码区的 起始交错几个核苷酸，如起始交错几个核苷酸，如E.coli中中trpE-trpD和和t

26、rpB- trpA的交接处就是。的交接处就是。 X174 颗粒颗粒 G4 DNA 2. 大肠杆菌的大肠杆菌的DNA顺序组织顺序组织 E.coli染色体是由染色体是由4.2106bp组成的双链环状组成的双链环状DNA。 (1)E.coli的很多基因是以操纵子的形式组织起来的。的很多基因是以操纵子的形式组织起来的。 这些功能上相关的结构基因转录在一个这些功能上相关的结构基因转录在一个mRNA分分 子上，但也并不是所有功能相关的基因都组织在子上，但也并不是所有功能相关的基因都组织在 一起，例如与一起，例如与E.coli复制有关的十多个基因散布复制有关的十多个基因散布 在整个染色体的各个部分。在整个染

27、色体的各个部分。 (2)蛋白质基因绝大多数以单拷贝的形式存在，以蛋白质基因绝大多数以单拷贝的形式存在，以 RNA为最终产物的基因，它们的拷贝数往往不止为最终产物的基因，它们的拷贝数往往不止 一个。一个。 （3）位于转录控制区域的）位于转录控制区域的DNA顺序的组织形式是顺序的组织形式是 多种多样的，不同的组织形式有不同的调控功能。多种多样的，不同的组织形式有不同的调控功能。 a. 乳糖操纵子乳糖操纵子 b.色氨酸操纵子色氨酸操纵子 c. 衰减子衰减子 乳乳 糖糖 操操 纵纵 子子 的的 负负 调调 控控 调节调节 基因基因 操纵操纵 基因基因 乳糖结构基因乳糖结构基因 P LacZLacYLa

28、ca mRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 基基 因因 关关 闭闭 启启 动动 子子 O R PLacZLacYLaca 调节调节 基因基因 操纵操纵 基因基因 乳糖结构基因乳糖结构基因 启启 动动 子子 O R mRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白 （无活性）（无活性） 基基 因因 表表 达达 mRNA A、乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构 B、乳糖酶的诱导乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控 RLacZLacYLaca mRNA mRNAZmRNAYmRNAa 基基 因因 表表 达达 CAP 基因基因

29、结构基因结构基因 T CAP O CAP结结 合部位合部位 RNA 聚合酶聚合酶 T cAMP -CAP P 葡萄糖葡萄糖 分解代分解代 谢产物谢产物 腺苷酸腺苷酸 环化酶环化酶 磷酸二磷酸二 酯酶酯酶 ATP cAMP 5-AMP 抑制抑制 激活激活 葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系 cAMP CAP：降解物基因活化蛋白（降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein） 降低降低cAMP浓度浓度 使使CAP呈失活状态呈失活状态 c. 衰减子衰减子 衰减子：衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用在转录水平上调节基因表达的衰减作用，

30、用 于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减子衰减子 是一种位于结构基因上游前导区的终止子。是一种位于结构基因上游前导区的终止子。 （二）真核生物（二）真核生物DNA顺序组织顺序组织 真核生物真核生物DNA比原核生物比原核生物DNA大的多，大的多，DNA顺顺 序组织也相应地复杂得多。序组织也相应地复杂得多。 1. 真核生物真核生物DNA序列的类型序列的类型 2. 卫星卫星DNA 3. 断裂基因断裂基因 4. 增强子增强子 5. 转座子转座子 1. 真核生物真核生物DNA序列的类型序列的类型 根据根据DNA复性动力学的研究，复性动力学的研究，DNA序列可以

31、分为序列可以分为 四种类型：四种类型： （1）单拷贝序列（单一序列，非重复序列）单拷贝序列（单一序列，非重复序列,single copy sequence）：）：在一个基因组中只有一个拷贝。在一个基因组中只有一个拷贝。 单拷贝序列最重要的作用是编码功能。单拷贝序列最重要的作用是编码功能。真核生物基真核生物基 因组中单拷贝序列约占因组中单拷贝序列约占4070，但编码序列只，但编码序列只 占单拷贝序列的一小部分，所以单拷贝序列除了编占单拷贝序列的一小部分，所以单拷贝序列除了编 码以外还有其它功能。码以外还有其它功能。 （2）轻度重复序列）轻度重复序列(slightly repetitive seq

32、uence): 在一个基因组有在一个基因组有210个拷贝（但个拷贝（但23个拷贝往往个拷贝往往 被看作非重复序列）。例如组蛋白基因和酵母被看作非重复序列）。例如组蛋白基因和酵母 tRNA基因属轻度重复序列。基因属轻度重复序列。 （3）中度重复序列）中度重复序列(moderately repetitive sequence): 10几百拷贝，占基因组的几百拷贝，占基因组的1040（小鼠占（小鼠占20， 果蝇中占果蝇中占15）中度重复序列一般是不编码的序列，）中度重复序列一般是不编码的序列， 据认为在基因调控中起重要作用，包括开启或关闭基据认为在基因调控中起重要作用，包括开启或关闭基 因的活性，因

33、的活性，DNA复制的起始，促进或终止转录，其转复制的起始，促进或终止转录，其转 录产物参与录产物参与hnRNA的处理等。它们可能是的处理等。它们可能是DNA复制和复制和 转录的起始、终止等有关的酶和蛋白质因子的识别位转录的起始、终止等有关的酶和蛋白质因子的识别位 点。这种重复序列的平均长度大约点。这种重复序列的平均长度大约300bp，它们与非它们与非 重复序列相间排列。重复序列相间排列。 无编码功能的中度重复序列无编码功能的中度重复序列 如：如： AluAlu 家族家族 有编码功能的中度重复序列有编码功能的中度重复序列 如：如： rDNArDNA tDNAtDNA HistoneHistone

34、 gene gene a a、 以以AluAlu序列为代表的不编码序列序列为代表的不编码序列 AluAlu family family（AluAlu 家族）：在长约家族）：在长约300bp300bp的片段中，大的片段中，大 多数片段含有一个限制性内切酶多数片段含有一个限制性内切酶AluAlu的酶切位点的酶切位点（AGCTAGCT） 均匀分散在整个均匀分散在整个genomegenome中的非重复序列间中的非重复序列间 在人类在人类genomegenome中占中占1 1 3 3 AluAlu序列是一个编码序列是一个编码7SL RNA7SL RNA的基因衍生来的的基因衍生来的 7SL RNA-7SL

35、 RNA-一种信号识别颗粒的组分一种信号识别颗粒的组分 b b、 有编码基因产物的中等重复序列有编码基因产物的中等重复序列 rDNArDNA 、tDNAtDNA、HistoneHistone gene gene clustercluster往往以基因家族往往以基因家族 的形式组织的形式组织 低等真核生物低等真核生物 10-2010-20% % 高等植物高等植物 8080% % repetitiverepetitive sequence sequence 高等动物高等动物 50% （4）高度重复序列（）高度重复序列（highly repetitivesequence):几几 百几百万个拷贝。每一

36、种高度重复序列中，一条链百几百万个拷贝。每一种高度重复序列中，一条链 含含T.G较多，增加了它的浮力密度，因此在变性时成为较多，增加了它的浮力密度，因此在变性时成为 重链，另一条成为轻链。这种两条链的不对称性常常重链，另一条成为轻链。这种两条链的不对称性常常 是许多高度重复序列的特征之一。是许多高度重复序列的特征之一。高度重复序列一般高度重复序列一般 不转录，不转录，因为在这些极其简单的核苷酸顺序上缺少转因为在这些极其简单的核苷酸顺序上缺少转 录所必需的启动子。大多数高等真核生物的录所必需的启动子。大多数高等真核生物的DNA都会都会 有有20以上的高度重复序列。以上的高度重复序列。分布于着丝点

37、分布于着丝点, 端粒区端粒区, 结构基因两侧。结构基因两侧。 2. 卫星卫星DNA 在高度重复序列中，常有一些在高度重复序列中，常有一些A.T含量很高的含量很高的 简单重复序列，（例如螃蟹简单重复序列，（例如螃蟹DNA含有的简单重复含有的简单重复 序列序列A.T含量可高达含量可高达97）由于）由于A.T段浮力密度小，段浮力密度小， 所以在所以在 CsCl密度梯度离心中很容易与总体密度梯度离心中很容易与总体DNA 分离开，分离出来的分离开，分离出来的DNA称为卫星称为卫星DNA。 卫星卫星DNA位于着丝点位于着丝点(centromere)附近的异染附近的异染 色质区，人们早就知道异染色质区的色质

38、区，人们早就知道异染色质区的DNA是不表是不表 达的，不产生达的，不产生RNA和蛋白质产物，细胞内也确实和蛋白质产物，细胞内也确实 不存在与卫星不存在与卫星DNA序列相应的序列相应的RNA。卫星卫星DNA 在着丝点处的分布可能与细胞分裂时染色体的运在着丝点处的分布可能与细胞分裂时染色体的运 动有关。动有关。 根据重复频率和大小又可分为小卫星和微卫星根据重复频率和大小又可分为小卫星和微卫星DNADNA 数目可变的串联重复或数目可变的串联重复或小卫星小卫星 ( Variable number tandem repeats . VNTR ) 短的串联重复短的串联重复 5-50 copies 5-50

39、 copies 有共同的核心序列，有共同的核心序列， 同一群体中个体间重复次数变动很大，所以个体间长度变同一群体中个体间重复次数变动很大，所以个体间长度变 化很大（化很大（DNADNA长度多态性）长度多态性） 可利用其得到可利用其得到DNADNA指纹图（指纹图（DNA finger printingDNA finger printing） DNA指纹图的制作指纹图的制作 DNA指纹图在法医上得到广泛应用指纹图在法医上得到广泛应用 限制性内切酶切割限制性内切酶切割DNA 电泳分离不同长度的电泳分离不同长度的DNA片段片段 小卫星探针与之杂交小卫星探针与之杂交 显示不同长度的小卫星片段显示不同长度

40、的小卫星片段 微卫星（微卫星（MicrosatelliteMicrosatellite) ) 又称简单序列重复（又称简单序列重复（simple simple Sequence Repeat, SSR)Sequence Repeat, SSR) 一般以一般以1 16 6个碱基为核心序列个碱基为核心序列 存在于基因组的广泛区域：基因的间隔区，内含子，外显存在于基因组的广泛区域：基因的间隔区，内含子，外显 子，调控区子，调控区 不同物种，微卫星含量不同：真核生物平均不同物种，微卫星含量不同：真核生物平均5050150kb150kb一一 个微卫星个微卫星 不同微卫星在不同物种中丰度不同：哺乳动物基因组

41、不同微卫星在不同物种中丰度不同：哺乳动物基因组( (AC)nAC)n 最丰富，植物基因组最丰富，植物基因组( (AT)nAT)n最丰富最丰富 真核生物基因组中，二核苷酸微卫星最丰富，三核苷酸微真核生物基因组中，二核苷酸微卫星最丰富，三核苷酸微 卫星比二核苷酸微卫星低卫星比二核苷酸微卫星低1010倍，四核苷酸微卫星更少倍，四核苷酸微卫星更少 作为作为DNADNA分子标记，构建遗传图谱分子标记，构建遗传图谱 微卫星微卫星SSR（Simple Sequence Repeats） 原理：微卫星原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序 列，每个重复单元的长度在110bp之间，常

42、见的微卫星如TGTGTG= (TG)n或AATAATAAT= (AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排 列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复 次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR 座位两侧一般是相保守的单拷贝序，据此可设计物，其关键是首先要了解 SSR座位的侧翼序列Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。 技术路线：技术路线： 建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列， 设计特异性引物来扩增SSR序列。后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过 比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SS

43、R座位上的多性。 微卫星的优点：微卫星的优点： （1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。据估计，在基因组中平均 3050kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中定位更多的基因提供了极 大的方便 （2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子 和杂合子。 （3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。通过 GeneScan检测，一个位点的检测一般可在24h内完成，且可同时进行多位点 的检测。 3. 断裂基因断裂基因 自从自从1977年年Roberts和和Sharp等人发现断裂基因以来，现等人发现断裂基因以来，现 以知道绝大多数真核生物基因都是断裂的。所谓

44、断裂基因就以知道绝大多数真核生物基因都是断裂的。所谓断裂基因就 是基因的编码序列在是基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为不编码的序分子上是不连续的，为不编码的序 列所隔开。列所隔开。编码的序列称为外显子编码的序列称为外显子(exon)，不编码的序列称不编码的序列称 为内含子为内含子(intron)。 真核生物的外显子也并非都编码氨基酸，除了真核生物的外显子也并非都编码氨基酸，除了 tRNA和和rRNA基因的外显子不编码蛋白质外，几基因的外显子不编码蛋白质外，几 乎全部蛋白质基因的首尾两个外显子都只有部分乎全部蛋白质基因的首尾两个外显子都只有部分 核苷酸序列编码氨基酸，还有完全不编码氨基酸

45、核苷酸序列编码氨基酸，还有完全不编码氨基酸 的外显子（如人类尿激酶基因的第一个外显子的的外显子（如人类尿激酶基因的第一个外显子的 88个核苷酸序列）。个核苷酸序列）。 内含子也并非都内含子也并非都“含而不显含而不显”，现在已经知道，现在已经知道， 有些内含子可以编码蛋白质，而这些蛋白质的功有些内含子可以编码蛋白质，而这些蛋白质的功 能又是与内含子序列的删除或传播扩散密切相关能又是与内含子序列的删除或传播扩散密切相关 的。的。 真核生物基因断裂结构的一个重要特点是外显真核生物基因断裂结构的一个重要特点是外显 子子内含子连接区（边界序列）的高度保守性和碱基内含子连接区（边界序列）的高度保守性和碱基

46、 序列的特异性。边界序列有两个重要特征：序列的特异性。边界序列有两个重要特征： （1）内含子的两端序列之间没有广泛的同源性，因）内含子的两端序列之间没有广泛的同源性，因 此内含子两端序列不能互补。此内含子两端序列不能互补。 （2）边界序列虽然很短，但却是高度保守的，这一）边界序列虽然很短，但却是高度保守的，这一 序列与剪接机制密切相关，它是序列与剪接机制密切相关，它是RNA剪接的信号序剪接的信号序 列。序列分析表明，几乎每个内含子列。序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两端起始的两 个碱基都是个碱基都是GT，3端最后两个碱基总是端最后两个碱基总是AG，即即 5GTAG3。 由于内含子两端的接

47、头序列不同，因此可定向由于内含子两端的接头序列不同，因此可定向 标明内含子的两个末端，根据剪接加工过程沿内含标明内含子的两个末端，根据剪接加工过程沿内含 子自左向右进行的原则，一般将内含子子自左向右进行的原则，一般将内含子5端接头序端接头序 列称为左剪接位点，列称为左剪接位点，3端接头序列称为右剪接位点。端接头序列称为右剪接位点。 边界序列的保守性几乎存在于所有高等真核生边界序列的保守性几乎存在于所有高等真核生 物基因中，表明在这些基因中，可能存在着一个共物基因中，表明在这些基因中，可能存在着一个共 同的剪接加工机制。同的剪接加工机制。 4. 增强子增强子 增强子是指能使和它连锁基因的转录频率

48、明显增增强子是指能使和它连锁基因的转录频率明显增 加的加的DNA序列。序列。1981年，年，Benerji在研究兔含在研究兔含SV40 DNA-血红蛋白嵌合基因的表达时发现，血红蛋白嵌合基因的表达时发现，SV40 DNA的一个的一个140bp序列能强烈增加这种嵌合基因的序列能强烈增加这种嵌合基因的 表达，这是人们发现的第一个增强子。该增强子含表达，这是人们发现的第一个增强子。该增强子含 有两个正向重复序列，每个长有两个正向重复序列，每个长72bp 。目前在病毒、目前在病毒、 植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子存在。植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子存在。 （1) 增强效应十分明显。

49、增强效应十分明显。 （2）增强效应与其位置和取向无关。增强效应与其位置和取向无关。 （3）增强子大多为重复序列，一般长约）增强子大多为重复序列，一般长约50bp， 适合与某些蛋白因子结合。适合与某些蛋白因子结合。 （4）其增强效应有严密的组织和细胞特异性。）其增强效应有严密的组织和细胞特异性。 （5)增强子没有基因专一性，可以在不同的基因增强子没有基因专一性，可以在不同的基因 组合上表现增强效应。组合上表现增强效应。 （6）许多增强子还受外部信号的调控。许多增强子还受外部信号的调控。 作为基因表达的重要元件，增强子通常具有下作为基因表达的重要元件，增强子通常具有下 列性质：列性质： 5. 转座

50、子（转座子（transposon,Tn） 是位于染色体是位于染色体DNA上可自主复制和移动的基本单上可自主复制和移动的基本单 位。位。转座子不仅存在于原核细胞（如转座子不仅存在于原核细胞（如E.coli）和低和低 等真核细胞（如酵母）中，也同样存在于高等真核等真核细胞（如酵母）中，也同样存在于高等真核 生物中，如玉米中就发现至少有四种明显不同的影生物中，如玉米中就发现至少有四种明显不同的影 响突变和基因重排的转座子，果蝇中也发现了多个响突变和基因重排的转座子，果蝇中也发现了多个 在基因组内随机分布而且能重复移动的转座子。在基因组内随机分布而且能重复移动的转座子。 自然界中第一个被发现的转座成分

51、就是玉米中的自然界中第一个被发现的转座成分就是玉米中的 “控制成分控制成分”。Barbara Mclintock（1902-1992） 从从1942年到美国冷泉港实验室后就开始进行玉米控年到美国冷泉港实验室后就开始进行玉米控 制成分的研究（玉米中决定体细胞变异的控制因子，制成分的研究（玉米中决定体细胞变异的控制因子， 事实上就是转座子），事实上就是转座子），1951年发表了她关于玉米控年发表了她关于玉米控 制成分的论文。她的开创性工作打破了孟德尔关于制成分的论文。她的开创性工作打破了孟德尔关于 基因在各个独立的染色体上固定排列的僵化概念。基因在各个独立的染色体上固定排列的僵化概念。 尽管在当时

52、几乎不能被科学界所接受，尽管在当时几乎不能被科学界所接受，30多年后终多年后终 于在分子水平上得到证实，于在分子水平上得到证实，1983年她获得了诺贝尔年她获得了诺贝尔 生理学奖。生理学奖。 nMcClintockMcClintock发现，玉米籽粒的颜色很不稳定，有发现，玉米籽粒的颜色很不稳定，有 时籽粒出现斑点，她认为遗传因子可以移动，从时籽粒出现斑点，她认为遗传因子可以移动，从 染色体的一个位置跳到另一位置，从一个染色体染色体的一个位置跳到另一位置，从一个染色体 跳到另一染色体。这种能自发转移的遗传因子，跳到另一染色体。这种能自发转移的遗传因子， 现在通称转座因子。现在通称转座因子。 n玉

53、米的控制因子可以在基因组内移动，其中有一玉米的控制因子可以在基因组内移动，其中有一 个叫做个叫做解离因子解离因子（DsDs，dissociationdissociation） n解离因子解离因子DsDs经常变动在染色体上的位置，影响邻经常变动在染色体上的位置，影响邻 近基因的作用。例如当近基因的作用。例如当DsDs基因插入到色素基因基因插入到色素基因C C 的近旁或中间时，玉米籽粒不能形成色素，但当的近旁或中间时，玉米籽粒不能形成色素，但当 DsDs离开离开C C基因后，基因后， C C基因所受到的抑制作用即被基因所受到的抑制作用即被 解除，玉米籽粒又出现色素。解除，玉米籽粒又出现色素。 nD

54、sDs的改变受的改变受激活因子激活因子(Ac(Ac，activator) activator) 的影响。的影响。 nAcAc可位于基因组中任何其他地方。可位于基因组中任何其他地方。 nAcAc的存在可以解除的存在可以解除DsDs对对C C的抑制作用，从而使色素的抑制作用，从而使色素 基因基因C C得以表达。所以在胚乳发育期间，由于得以表达。所以在胚乳发育期间，由于AcAc的的 作用，作用，DsDs转座而离开色素基因转座而离开色素基因C C时，玉米籽粒便出时，玉米籽粒便出 现色素斑点。现色素斑点。 n有时激活因子有时激活因子AcAc丢失，遂使解离因子丢失，遂使解离因子DsDs趋向稳定，趋向稳定，

55、 从而色素基因从而色素基因C C的表达被部分或完全抑制，玉米胚的表达被部分或完全抑制，玉米胚 乳就呈现浅色甚而无色。乳就呈现浅色甚而无色。 n因为因为DsDs和和AcAc这两控制因子频频地转移位置，所以这两控制因子频频地转移位置，所以 在玉米籽粒上显示出散开的斑斑小点。在玉米籽粒上显示出散开的斑斑小点。 在细菌中发现两种类型的转座子：在细菌中发现两种类型的转座子： （1）简单转座子（插入序列）简单转座子（插入序列insertion sequence） （2）复合转座子（复合转座子（composite transpson） 插入序列：插入序列有许多种，每一种的插入序列：插入序列有许多种，每一种的

56、 命名以编写字母命名以编写字母IS开头，后加不同数字。插入开头，后加不同数字。插入 序列是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常序列是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常 组分，例如组分，例如E.coli某一标准菌株含有某一标准菌株含有8个拷贝的个拷贝的 IS1，含含5个拷贝的个拷贝的IS2和和IS3等。等。 插入序列的特点：插入序列的特点： （1）每种插入序列都在两端含有短的末端倒置（转）每种插入序列都在两端含有短的末端倒置（转） 重复序列，其长度大多介于重复序列，其长度大多介于15bp25bp之间。就一种之间。就一种 IS而言，两个末端倒置重复的碱基序列高度相关，而言，两个末端倒置重复的碱基序列高度相关， 但通常不完全一致。但通常不完全一致。 （2）当一个转座子转座时，基因组）当一个转座子转座时，基因组DNA上新的靶点上新的靶点 序列出现倍生，使插入序列的两侧各有一段相同的序列出现倍生，使插入序列的两侧各有一段相同的 靶点序列。它通常很短，大多数介于靶点序列。它通