基础生物化学第10(1)dna章

1、10 DNA10 DNA的生物合成的生物合成 Chapter 10 DNA BiosynthesisChapter 10 DNA Biosynthesis， ReplicationReplication 本章重点与难点本章重点与难点 重点：掌握中心法则；半保留复制、半不重点：掌握中心法则；半保留复制、半不 连续复制、反转录、基因工程的概念；参连续复制、反转录、基因工程的概念；参 与与DNADNA复制的有关酶类和蛋白质及复制的有关酶类和蛋白质及DNADNA的复的复 制过程；制过程；DNADNA损伤修复的方式。损伤修复的方式。 难点：对难点：对DNADNA的半保留复制、半不连续复的半保留复制、半不

2、连续复 制的理解。制的理解。 复制（复制（DDDPDDDP） 转录（转录（DDRPDDRP） 翻译翻译 DNA mRNA DNA mRNA 蛋白质蛋白质 反转录（反转录（RDDPRDDP） RNA RNA 复制（复制（RDRPRDRP） 复制复制( (replication) 是指遗传物质的传代，以亲代（母链）是指遗传物质的传代，以亲代（母链） DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。 复制复制 亲代亲代DNA 子代子代DNA 一、一、DNADNA复制的基本规律复制的基本规律 （一般原理）（一般原理） Basic Rules of DNA Replication l复制的方式复

3、制的方式 半保留复制半保留复制(semi-conservative replication) l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) l双向复制双向复制(bidirectional replication) l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) （一）（一）DNA复制是半保留复制复制是半保留复制(semi-conservative replication) DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两解开为两 股单链，各自作为模板股单链，各自作为模板(template)按碱基配对按碱基配对 规律，合成与模板互补

4、的子链。子代细胞的规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另，一股单链从亲代完整地接受过来，另 一股单链则完全从新合成。两个子细胞的一股单链则完全从新合成。两个子细胞的 DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制碱基序列一致。这种复制 方式称为方式称为半保留复制半保留复制。 半保留复制的概念半保留复制的概念 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T

5、C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成 的复制叉的复制叉 子代子代DNA 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式（散布式）混合式（散布式） lDNADNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在19581

6、958年由年由M. Meselson M. Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先 将大肠杆菌在含将大肠杆菌在含15 15N N的培养基中培养约十五代，使其 的培养基中培养约十五代，使其DNADNA中中 的碱基氮均转变为的碱基氮均转变为15 15N N。将大肠杆菌移至只含 。将大肠杆菌移至只含14 14N N的培养基 的培养基 中同步培养一代、二代、三代。分别提取中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNADNA，作密度梯，作密度梯 度离心，可得到下列结果：度离心，可得到下列结果： 密度梯度实验密度

7、梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。 含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌 培养于普培养于普 通培养液通培养液 第一代第一代 继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液 第二代第二代 梯度离心结果梯度离心结果 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A 的的碱基序列碱基序列一致一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗 传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。 半保留复制的意义半保留复制的意义 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但但不是绝对的不是绝对的。 原核生物

8、复制时，原核生物复制时，DNA从原点从原点 (起始点，起始点， origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向向两个方向解链，形成两个延伸方向 相反的复制叉，称为相反的复制叉，称为双向复制双向复制。 （二）（二）DNA复制是固定起点的双向复复制是固定起点的双向复 制制 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象 A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C 真核生物每个染色体有多个复制真核生物每个染色体有多个复制 原点，是多复制子的复制。原点

9、，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻复制原点之间习惯上把两个相邻复制原点之间 的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子(replicon) 。复。复 制子是能够独立完成复制的功能单位。制子是能够独立完成复制的功能单位。 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制子复制子 3 （三）（三）DNA复制是半不连续复制复制是半不连续复制 3 5 3 5 解链方向解链方向 3 5 3 3 5 领头链领头链 (leading strand) 随从链随从链 (lagging strand) 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的

10、，这 股链称为股链称为先导链先导链或或领头链领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺 着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随随 后链后链或或随从链随从链。复制中的不连续片段（约。复制中的不连续片段（约1000个核个核 苷酸）称为苷酸）称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment，1968)。 先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连 续复制或复制的续复制或复制的半不连续性半不连续性。 二、二、DNA复制的酶学复制的酶学 （DNADN

11、A复制相关的酶和蛋白质）复制相关的酶和蛋白质） The Enzymology of DNA Replication 参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DDDP或或DNA-pol 模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子 （一）复制的化学反应（一）复制的化学

12、反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 录录 聚合反应的特点聚合反应的特点 DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板 DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA 链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可 分别作为模板进行复制。 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行（模板方向为（模板方向为 3 5 ，合成方向为，合成方向为5 3 。）。） （二）（二）DNA聚合酶聚合酶 全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA- dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性：1. 53

13、 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性 ? 能切除突变的能切除突变的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。 能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 1 1、原核生物的、原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 催化催化DNA 聚合聚合 参与参与DNA损损

14、伤的应急状伤的应急状 态修复态修复 修复合成、修复合成、 切除引物、切除引物、 填补空隙填补空隙 功能功能 2040400分子数分子数/细胞细胞 1011亚基数亚基数 +-+5 外切酶活性外切酶活性 + 5 外切酶活性外切酶活性 +5 聚合酶活性聚合酶活性 pol IIIpol IIpol I E. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶 可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性 无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子数分子数/细胞细胞 多亚基不对称多亚基不对称 二聚体二聚体 ？单肽链单肽链组成组成 250

15、120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性 无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子数分子数/细胞细胞 多亚基不对称多亚基不对称 二聚体二聚体 ？单肽链单肽链组成组成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。 DNA-pol （109kD） 323个氨基酸个氨基酸

16、小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能：功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中

17、真正起催化作用的酶。 DNA-pol ：由十种亚基组成，其中：由十种亚基组成，其中亚基具有亚基具有 5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有复制的酶活性，因而具有复制DNADNA的功能；而的功能；而 亚基具有亚基具有3535外切酶的活性，因而与外切酶的活性，因而与DNADNA复制的校复制的校 正功能有关。正功能有关。 (250kD) 2 2、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。 在复制过程中起校读、修复

18、和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。口的作用。 在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 填填补补引引物物 空空隙隙，切切 除除修修复复， 重重组组 延延长长子子 链链的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 线线粒粒体体 DNA复复 制制 低低保保 真真度度 的的复复 制制 起起始始引引 发发，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.0

19、16.5分分子子量量（kD） DNA-pol 填填补补引引物物 空空隙隙，切切 除除修修复复， 重重组组 延延长长子子 链链的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 线线粒粒体体 DNA复复 制制 低低保保 真真度度 的的复复 制制 起起始始引引 发发，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD） DNA-pol l在真核生物中，目前发现的在真核生物中，目前发现的DNADNA聚合酶有五种，聚合酶有五种， 分别命名为分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶

20、（pol pol ），），DNADNA聚合聚合 酶酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ）。）。 l其中，参与染色体其中，参与染色体DNADNA复制的是复制的是pol pol （延长（延长 随从链）和随从链）和pol pol （延长领头链），参与线粒（延长领头链），参与线粒 体体DNADNA复制的是复制的是pol pol ，polpol与与DNADNA损伤修复、损伤修复、 校读和填补缺口有关，校读和填补缺口有关，pol pol 只在其他聚合酶只在其他聚合酶 无活

21、性时才发挥作用。无活性时才发挥作用。 （三）复制保真性的酶学依据（三）复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准 确传代的基本原理。确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制： DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择 1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正

22、确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。 2 2、复制的保真性和碱基选择、复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键） 与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应 的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时复制出错时

23、DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 （四）复制中的分子解链及（四）复制中的分子解链及DNA 分分 子拓扑学变化子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。 1、解螺旋酶、引物酶和单链、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白 理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B) 稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA 结结合合蛋蛋白白 SSB 催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG

24、(dnaG) 运运送送和和协协同同DnaB DnaC (dnaC) 解解开开DNA双双链链 解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB) 辨辨认认起起始始点点 DnaA (dnaA) 蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能 原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质 E. Coli 基因图基因图 目目 录录 解螺旋酶解螺旋酶(helicase) 利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链 解开成为两条单链解开成为两条单链 引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(singl

25、e stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单 链的完整链的完整 l解螺旋酶解螺旋酶 （unwinding enzyme） ，又称，又称 解链酶或解链酶或rep蛋白，蛋白， 是用于解开是用于解开DNA双双 链的酶蛋白，每解链的酶蛋白，每解 开一对碱基，需消开一对碱基，需消 耗两分子耗两分子ATP。目。目 前发现存在至少存前发现存在至少存 在两种解螺旋酶。在两种解螺旋酶。 l引发体引发体(primosome)(primosome)由引发前体与引物酶由引发前体与引物酶 （primaseprimase

26、）组装而成。）组装而成。 l引物酶本质上是一种依赖引物酶本质上是一种依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶 （DDRPDDRP），该酶以），该酶以DNADNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNARNA短链引短链引 物物(primer)(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH3-OH，使子代，使子代DNADNA链能链能 够开始聚合。够开始聚合。 1010 8 8 局部解链后局部解链后 2、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 目目 录录 拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点 既能水解既能水解 、又能

27、连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶 分分 类类 拓扑异拓扑异 构酶构酶 切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。 反应反应不需不需ATP。 拓扑异拓扑异 构酶构酶 切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能供能，连接断端，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。 作用机制作用机制 目目 录录 （五）（五）DNA连接酶连接酶 连接连接

28、DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相 邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式 P O O- O- O HO5 P O O- O- O 3 3 5 DNA连接酶连接酶 ATP ADP 53 53 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一

29、。 功能功能 三、三、DNA生物合成过程生物合成过程 The Process of DNA Replication 1 1、复制的起始、复制的起始 需要解决两个问题：需要解决两个问题： 1） DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。 2）合成引物，提供）合成引物，提供3 -OH末端。末端。 （一）原核生物的（一）原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTG

30、GATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列 5 3 5 3 a. DNA解链解链 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 引物引物 酶酶 SSB 3 5 3 5 b. 引发体和引物引发体和引物 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分

31、子。分子。 引物引物 3 HO 5 引物引物 酶酶 复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 预引发： 1解旋解链，形成复制叉： n 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及 双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单 链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单 链DNA上，形成复制叉。 n DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这 种叉状结构称为复制叉。 2引发体组装： n由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始 点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起 组装形成引发体。 引发： n在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成 一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟 基（3-OH

32、）。 2 2、复制的延长、复制的延长 复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 聚合子代DNA： n由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链 为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原 核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶； 而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链) 和（延长领头链）。 引发体移动： n引发体向前移动，解开新的局部双螺旋， 形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引 物，继续进行链的延长。

33、 5 5 3 3 5 5 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 3 DNA-pol 领头链的合成领头链的合成 随从链的合成随从链的合成 阶段一阶段一阶段二阶段二 阶段三阶段三阶段四阶段四 复复 制制 过过 程程 简简 图图 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制 片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。 ori ter E.coli 82 32 ori ter SV40 50 0 3 3、复制的终止、复制的终止 5 5 5 RNA酶酶 OHP 5 DNA-pol dNTP 5 5 P

34、 ATP ADP+Pi 5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接 去除引物，填补缺口： n在原核生物中，由DNA聚合酶来水解 去除RNA引物，并由该酶催化延长引物 缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸 酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引 物的去除，由一种特殊的核酸酶来水 解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。 连接冈崎片段： n在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷 酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完 整的DNA长链。 哺乳动物的哺乳动物的 细胞周期细胞周期 DNA合成期合成期 G1 G2 S M （二）真核生物的（二）真核生物的DNA生物合成生物合成

35、 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关 键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活 性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而 实施调控作用。实施调控作用。 真核生物每个染色体有多个起始点，是多真核生物每个染色体有多个起始点，是多 复制子复制。复制子复制。复制有时序性复制有时序性，即复制子以，即复制子以 分组方式激活而不是同步起动。分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）（引物酶活性） 和和pol（解螺旋酶活性）参与。还

36、需拓扑酶（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶 和复制因子和复制因子(replication factor, RF)。 1 1、复制的起始、复制的起始 3 5 5 3 领头链领头链 3 5 3 5 亲代亲代DNA 随从链随从链 引物引物 核小体核小体 2 2、复制的延长、复制的延长 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物， 去除后留下空隙。去除后留下空隙。 3 3、复制的终止、复制的终止 5 3 3 5 5 3 3

37、5 + 5 3 3 3 3 5 5 切除引物的两种机制切除引物的两种机制 端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。 功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性 结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基 的短的短 序列。序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG 端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒

38、酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成 端粒酶的催端粒酶的催 化延长作用化延长作用 爬爬 行行 模模 型型 DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链 进一步加工进一步加工 四、逆转录和其他复制方式四、逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)

39、逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶 （一）逆转录病毒和逆转录酶（一）逆转录病毒和逆转录酶 反转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合 成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA 的方向相反。 1970年，Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳 氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。 致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血 病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞 后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。 经过改造后可以作为基因治疗的载体。 放线菌素D（抑制以DNA为模

40、板的反应，复制和转录） 能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复 制过程必然涉及DNA。 Bader 用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白 质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒 （RSV），证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的， 而不是感染后在宿主细胞中新合成的。 反转录酶反转录酶 由一个亚基和一个亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。 （1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互 补的DNA，形成RNADNA杂种分子）。 （2）RNase H酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA，可 沿35和53两个方向起外切酶作用。 （3）DNA指导的

41、DNA聚合酶活力。 模板：模板：RNA或或DNA 以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是 带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。 引物：引物：RNA或或DNA 底物：底物：dNTP 二价阳离子：二价阳离子：Mg2+或Mn2+ 真核mRNA3端有polyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶的 模板，合成cDNA。 逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板模板 逆转录酶逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链杂化双链 RNA酶酶 单链单链DNA 逆转录酶逆转录酶 双链双链DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T T A

42、AAA SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶 碱水解碱水解 T T T T 分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法 称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转 录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互 补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNA cDNA complementary DNA （二）逆转录研究的意义（二）逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中 的重大发现。的重大发

43、现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样 兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意 到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 滚环复制滚环复制(rolling circle replication) （三）滚环复制和（三）滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和 M13噬菌体等。噬菌体等。 3 -OH 5 -P 5 5 5 3 3 3 3 5 滚环复制滚环复制 5 5 3 3 5 dNTP DNA-po

44、l D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 的复制形式。的复制形式。 五、五、DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息遗传物质的结构改变而引起的遗传信息 改变，均可称为改变，均可称为突变。突变。 在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNA突变称为突变称为DNA 损伤损伤(DNA damage)。 一些物理化学因子如紫外线、电离辐射一些物理化学因子如紫外线、电离辐射 和化学诱变剂均可引起和化学诱变剂均可

45、引起DNA损伤，破坏其结损伤，破坏其结 构与功能。然而在一定条件下，生物机体能构与功能。然而在一定条件下，生物机体能 使这种损伤得到修复。使这种损伤得到修复。 从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上分子上 碱基的改变。碱基的改变。 （一）突变的意义（一）突变的意义 1 1、突变是进化、分化的分子基础、突变是进化、分化的分子基础 2 2、突变导致基因型改变、突变导致基因型改变 3 3、突变导致死亡、突变导致死亡 4 4、突变是某些疾病的发病基础、突变是某些疾病的发病基础 （二）引发突变的因素（二）引发突变的因素 物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, U

46、V)、各种辐射、各种辐射 UV 化学因素化学因素 常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂 化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变 碱基类似物碱基类似物 如：如：5-BU A 5-BU G - A - - T - - G - - C - 羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C - T - - A - - C - - G - 亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U - G - - C - - A - - T - 烷化剂烷化剂 如：氮芥类，如：氮芥类，Nitromins G mG G mG DNA缺失缺失G （三）突变的分子改变类型（三）突变的分子改变类型 错配错配 (mismatch) 缺失缺失

47、(deletion) 插入插入 (insertion) 重排重排 (rearrangement) 框移框移 (frame-shift) DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另 一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1）转换转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶 或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2)颠换颠换 1 1、错配、错配 镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基 N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链 CAC GTG 基因基因 正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基 N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链 CTC GAG 基因基因 2 2、缺失、缺失、插入插入和框移和框移 缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸