酶联免疫吸附试验的影响因素

1、 实验过程中的影响因素实验过程中的影响因素 终止与读数终止与读数 结果的判读结果的判读 试试 剂剂 加加 样样 温温 育育 样样 本本洗洗 板板 显显 色色 一、标一、标 本本 排泄物排泄物 血血 清清唾唾 液液尿液、粪便尿液、粪便 分泌物分泌物 体体 液液 血清标本血清标本 脂血标本脂血标本 溶血标本溶血标本 标本的保存标本的保存 标本的离心标本的离心 采血试管采血试管 采血试管采血试管 1.1.使用非抗凝标本（血清）；使用非抗凝标本（血清）； 肝素抗凝血浆会增加肝素抗凝血浆会增加ODOD值值;EDTA;EDTA、酶抑、酶抑 制剂制剂( (如如NaN3)NaN3)可抑制可抑制ELISAELI

2、SA检测系统中辣根检测系统中辣根 过氧化物酶活性过氧化物酶活性; ; 2. 2.最好使用最好使用一次性一次性玻璃试管玻璃试管或真空采血管或真空采血管. . 标本采集后，应先将标本标本采集后，应先将标本3737放置放置 30-6030-60分钟后采用分钟后采用3000r3000r /min /min离心离心15-2015-20分钟，取分钟，取 上清液加样。上清液加样。 标本的离心标本的离心 标本的离心标本的离心 强行离心分离血清，会使血清中仍残强行离心分离血清，会使血清中仍残 留部分纤维蛋白原，在留部分纤维蛋白原，在ELISAELISA测定过程中可测定过程中可 以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在

3、酶以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶 标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成 假阳（阴）性结果。假阳（阴）性结果。 标本的保存标本的保存 1. 1. 一周一周 - 2 - 24 4 保存；保存； 2. 2. 超过一周超过一周 - - 建议建议-20-20保存。保存。 3. 3. 冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓 缩而分布不均，加样前应充分缩而分布不均，加样前应充分混匀混匀。 标本的保存标本的保存 4. 4. 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或混浊或有沉淀的血清标本应先离心或 过滤，澄清后再检测。过滤，澄清后再检测。 5. 5

4、. 作多次检测，宜作多次检测，宜少量分装少量分装冰存冰存; ; 6. 6. 血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细 菌污染。菌污染。 避免细菌污染避免细菌污染 A. A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 的的 HRP HRP会产生假阳性；会产生假阳性； B. B.细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会 对对 抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶 酶酶 等蛋白水解酶）；等蛋白水解酶）； C. C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半半 乳糖苷酶本

5、身会对用相应酶作标记的测乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测 定定 方法产生非特异性干扰。方法产生非特异性干扰。 溶血标本溶血标本 1. ELISA1. ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或以辣根过氧化物酶标记抗原或 抗体；抗体； 2. 2. 红细胞破坏后可释放出大量的具有过红细胞破坏后可释放出大量的具有过 氧化物酶活性的血红蛋白；氧化物酶活性的血红蛋白； 3. 3. 残留的过氧化物酶催化底物产生非特残留的过氧化物酶催化底物产生非特 性显色导致结果假阳性。性显色导致结果假阳性。 脂血标本脂血标本 1. 1. 脂质小粒粘附在反应孔内壁；脂质小粒粘附在反应孔内壁； 2. 2. 非离子型洗涤剂很难洗掉

6、反应板上干非离子型洗涤剂很难洗掉反应板上干 扰性物质的非特异性吸附，引起吸光扰性物质的非特异性吸附，引起吸光 度度A A值升高，易造成假阳性结果。值升高，易造成假阳性结果。 餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离 心速度不合适等，都可使分离的血清标本中残留着大量的心速度不合适等，都可使分离的血清标本中残留着大量的 脂质小粒脂质小粒。 二、二、 试试 剂剂 1.试剂盒保存于2-8 2.使用前应先将检测试剂 盒放置室温平衡15-30 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。 3.观察外包装和内组份有无漏液。 三、加 样 仔细注意加样全

7、部过程仔细注意加样全部过程 移液器的使用移液器的使用 及时放入孵育箱及时放入孵育箱 标本较多时，请分批操作标本较多时，请分批操作 试剂的滴加试剂的滴加 加样过程应注意：加样过程应注意： A. A. 加样不可太快；加样不可太快； B. B. 要避免加在孔壁上部；要避免加在孔壁上部； C. C. 不可溅出；不可溅出； D. D. 避免产生气泡；避免产生气泡； E. E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。头，加样后充分混匀。 试剂的滴加试剂的滴加 从滴瓶中滴加，应注意滴加的角度和从滴瓶中滴加，应注意滴加的角度和 速度速度。 滴加太快，很容易出现重复滴加或

8、加滴加太快，很容易出现重复滴加或加 在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非 包被区出现非特异吸附，从而引起非特异包被区出现非特异吸附，从而引起非特异 显色。显色。 移液器的使用 移液的方法及注意事项移液的方法及注意事项 枪头的装配枪头的装配 量程的调节量程的调节 量程的调节量程的调节 1.1.从大体积调为小体积从大体积调为小体积 2.2.从小体积调为大体积从小体积调为大体积 在该过程中，千万不要将按钮旋出量在该过程中，千万不要将按钮旋出量 程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移 液枪液枪 枪头（吸液嘴）的装配枪头（吸液嘴）的装

9、配 使劲地在枪头盒子上敲几下使劲地在枪头盒子上敲几下 错误错误 将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微 用力左右微微转动即可使其紧密结合用力左右微微转动即可使其紧密结合 正确正确 枪头卡紧的标志是略为超过枪头卡紧的标志是略为超过O O型环，并可型环，并可 以看到连接部分形成清晰的密封圈以看到连接部分形成清晰的密封圈。 移液的方法移液的方法 前进移液法前进移液法 反向移液法反向移液法 一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液 体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量

10、程的液 体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。 重复操作移液法重复操作移液法 适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。 全血移液法全血移液法 移液的注意事项移液的注意事项 1.1.吸取液体时，移液器保持竖直状态，将吸取液体时，移液器保持竖直状态，将 枪头插入液面下枪头插入液面下1 1厘米。厘米。 注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松 开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液 吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成 漏气漏

11、气。 移液的注意事项移液的注意事项 2.2.设定加样体积，不能大于加样枪标定的设定加样体积，不能大于加样枪标定的 移液范围移液范围 3. 3.加样吸嘴的洁净和装配加样吸嘴的洁净和装配 4. 4.吸取液体和排出液体动作都一定要慢。吸取液体和排出液体动作都一定要慢。 移液的注意事项移液的注意事项 5.5.加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性 的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）的液体（如浓酸、浓碱、有机物等） 6.6.不要用大量程的加样枪移取小体积的液不要用大量程的加样枪移取小体积的液 体，以免影响准确度体，以免影响准确度。 移液的注意事项移液的注意事项 7.7.如不使

12、用，要把移液枪的量程调至最如不使用，要把移液枪的量程调至最 大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保 护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。 8. 8.表面清洁：用表面清洁：用10%10%的次氯酸钠溶液或的次氯酸钠溶液或 70%70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。的酒精溶液清洁后，自然晾干。 9. 9.微量加样枪必须按要求定期进行校准。微量加样枪必须按要求定期进行校准。 四、温四、温 育育 1. 1. 抗原抗体反应必须在一定的温度条件抗原抗体反应必须在一定的温度条件 下反应一定的时间。下反应一定的时间。 2. 2. 温育所需时间与温度成反

13、比。温育所需时间与温度成反比。 3. 3. 最为常用的温育温度有最为常用的温育温度有3737和和室温室温， 其次是其次是4343和和2 288。 实际操作中应注意：实际操作中应注意： 温育温度的选择温育温度的选择 足够的反应时间足够的反应时间 “边缘效应边缘效应”的排除的排除 温育温度的选择温育温度的选择 1.1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中 时，孔内温度从室温升至时，孔内温度从室温升至3737，需要，需要 一定的时间；一定的时间； 2. 2.在临床实验室中，通常是将微孔板一在临床实验室中，通常是将微孔板一 放入温箱即开始计时，这样就很容易放入温箱即开始计时，这

14、样就很容易 造成实际测定中温育时间不够，弱阳造成实际测定中温育时间不够，弱阳 性样本测不出来的问题。性样本测不出来的问题。 “边缘效应边缘效应”的排除的排除 1.“1.“边缘效应边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，即外周孔显色较中心孔深; ; 2.2.有研究证实在温育中的热力学梯度可能是有研究证实在温育中的热力学梯度可能是 根本原因。根本原因。 3.3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通 常在常在2525左右）置于左右）置于3737温箱，板升温温箱，板升温 时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热 力学梯度。力学梯度。 总而

15、言之，在临床总而言之，在临床ELISAELISA测定中，要测定中，要 保证好的测定效果，应尽量采用保证好的测定效果，应尽量采用水浴水浴。 温育中让微孔板浮于水面上（浸入温育中让微孔板浮于水面上（浸入 1/31/3），或将），或将浸透水的沙布浸透水的沙布放入一大饭盒放入一大饭盒 中形成中形成湿盒湿盒，然后放于温箱中，这样可使，然后放于温箱中，这样可使 微孔板板孔底部直接与微孔板板孔底部直接与3737水或湿布接触，水或湿布接触， 而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应 溶液的温度迅速与温室平衡。溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗五、洗 板板 血清中残留的纤维蛋白丝

16、或洗涤液血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液 析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半 阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底， 导致导致“花板花板”造成假阳性或假阴性。造成假阳性或假阴性。 洗板的注意事项洗板的注意事项 1. 1. 要有适当的浸泡时间（要有适当的浸泡时间（30-6030-60秒）。秒）。 2. 2. 洗板机吸液要彻底，残余量低于洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul5ul。 3. 3. 洗液应调至适当的注出量，每孔应在洗液应调至适当的注出量，每孔应在 350ul-450ul 350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。之间，但不要

17、溢出孔外。 4.4.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不洗板次数应与说明书要求一致，尽量不 要私自增加或减少洗板次数。要私自增加或减少洗板次数。 5.5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH pH 值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH pH 值为值为7.47.40.20.2，水质宜新鲜，长菌或有，水质宜新鲜，长菌或有 沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。 6. 6. 由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成 结晶，配制洗液时应完全溶解。结晶，配制洗液时应完全溶解。 7. 7.

18、稀释好的洗液稀释好的洗液44下可保存下可保存3535天。天。 8. 8. 洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好 的干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应的干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应 换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，避免交换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，避免交 叉污染。叉污染。 9. 9. 操作洗板机过程中要不时观察洗板操作洗板机过程中要不时观察洗板 机针孔内洗液的通畅状况，及时纠机针孔内洗液的通畅状况，及时纠 正，洗板机不用时应用去离子水清正，洗板机不用时应用去离子水清 洗几遍后关机。洗几遍后关机。 10.10.每周要进行保养清洗。每周要进行保养清洗。 六、显六、显 色

19、色 注意事项：注意事项： 1. 1. 检查底物溶液的有效性；检查底物溶液的有效性； 2. 2. 试剂显色时先加试剂显色时先加A A液，后加液，后加B B液，二者液，二者 不要颠倒。不要颠倒。 3. 3. 前后加入的间隔时间不超过前后加入的间隔时间不超过1010分钟。分钟。 4. 4. 若把若把A A液和液和B B液先混合，再加样显色，液先混合，再加样显色， 需要求二者等体积混合。需要求二者等体积混合。 5. A5. A、B B液应避免接触污染物。液应避免接触污染物。 6. 6. 不同厂家显色液不得混用。不同厂家显色液不得混用。 七、终止和读数七、终止和读数 肉眼判断结果时，显色浅不易观察，肉眼

20、判断结果时，显色浅不易观察， 影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测 结果，以保证结果一致性。结果，以保证结果一致性。 注意事项注意事项 1 1、酶标仪的波长是否合适或滤光片是否正确。、酶标仪的波长是否合适或滤光片是否正确。 2 2、单波长或双波长比色选择的问题。、单波长或双波长比色选择的问题。 ELISAELISA测定比色时，最好是使用双波长比色测定比色时，最好是使用双波长比色 3 3、加完终止液后、加完终止液后3030分钟内读取数据。分钟内读取数据。 4 4、保证酶标板的底部是清洁干燥的。、保证酶标板的底部是清洁干燥的。 双波长比色？双波长比色？ 双波长比

21、色测定能排除由微滴板本身、板双波长比色测定能排除由微滴板本身、板 孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等 对特异显色测定吸光度的影响，一般对特异显色测定吸光度的影响，一般不必设空不必设空 白孔白孔。 ELISA ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上测定中单个空白孔的非特异吸收上 有一定程度的不确定性；有一定程度的不确定性； 在在ELISAELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果的判读八、结果的判读 灰区的定义灰区的定义 灰区又称灰色带反应。就是把灰区又称灰色带反应。就是把ODOD值值 在在Cut of

22、fCut off值正负值正负20%20%这个范围内的标本这个范围内的标本 称为灰区标本。这个范围称为灰区。称为灰区标本。这个范围称为灰区。 灰区的处理灰区的处理 1.1.灰区是客观存在的，没有不存在灰区灰区是客观存在的，没有不存在灰区 的试剂，我们只是尽量减少灰区的出的试剂，我们只是尽量减少灰区的出 现比例。现比例。 2.2.减少灰区最有效的方法就是尽量将板减少灰区最有效的方法就是尽量将板 洗涤干净。洗涤干净。 3.严格控制温育时间。 其他的影响其他的影响 1. 1. 干扰物质的影响干扰物质的影响 常见的干扰物质如类风湿因子、常见的干扰物质如类风湿因子、 甲胎蛋白、某些自身抗体等，都会使甲胎蛋

23、白、某些自身抗体等，都会使 结果造成假阳性。结果造成假阳性。 2. 2. 药物的影响药物的影响 如高效价的乙肝免疫球蛋白等。如高效价的乙肝免疫球蛋白等。 思考题思考题 为什么多次实验重复性差为什么多次实验重复性差 （相同样本两次测定结果（相同样本两次测定结果 不一致）？不一致）？ 多次实验重复性差多次实验重复性差（相同样本两次测定结果不一致）（相同样本两次测定结果不一致） A. A. 血清标本未完全凝固即加入；血清标本未完全凝固即加入； B. B. 不同批号试剂盒中组分混用；不同批号试剂盒中组分混用； C. C. 加样；加样； D. D. 温育时间、洗板、显色时间不一致；温育时间、洗板、显色时间不一致； E. E. 孔内有污染物；孔内有污染物； F. F. 显色液滴加出现