食品中产毒霉菌的分离与鉴定

1、二、实验原理二、实验原理 三、实验器材三、实验器材 一、实验目的一、实验目的 四、实验步骤四、实验步骤 五、实验结果五、实验结果 一、实验目的一、实验目的 1 1 、学习并掌握食品中常见产毒霉菌分离、学习并掌握食品中常见产毒霉菌分离 纯化的主要方法和技术纯化的主要方法和技术; ;进一步熟练掌握进一步熟练掌握 食品检样的处理及梯度稀释技术；食品检样的处理及梯度稀释技术； 2 2 、掌握产毒霉菌的形态学鉴定技术，了、掌握产毒霉菌的形态学鉴定技术，了 解菌丝形态及其产孢结构在霉菌分类鉴解菌丝形态及其产孢结构在霉菌分类鉴 定中的重要性；定中的重要性； 二、实验原理二、实验原理 产毒霉菌极易在含糖的饼干

2、、面包、粮食等类食产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类食 品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半 知菌亚门中的知菌亚门中的曲霉属曲霉属、青霉属青霉属和和镰刀菌属镰刀菌属。其产生的。其产生的 毒素主要毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、 烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏 马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。 霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌产毒的条件霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌

3、产毒的条件 主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及 空气的流通情况空气的流通情况 。 曲霉属曲霉属：黄曲霉、赭曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、构巢：黄曲霉、赭曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、构巢 曲霉和寄生曲霉等；曲霉和寄生曲霉等； 青霉属青霉属：岛青霉、桔青霉、黄绿青霉、扩张青霉、圆：岛青霉、桔青霉、黄绿青霉、扩张青霉、圆 弧青霉、皱折青霉和荨麻青霉等；弧青霉、皱折青霉和荨麻青霉等； 镰刀菌属镰刀菌属：犁孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌：犁孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌 、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等；、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等；

4、其它菌属其它菌属 ：有绿色木霉、漆斑菌属、黑色葡萄状穗霉有绿色木霉、漆斑菌属、黑色葡萄状穗霉 等。等。 本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、 杂色曲霉、杂色曲霉、 构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢 产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。 1 1、营养菌丝体、营养菌丝体 由具横隔的分枝菌丝构成；无由具横隔的分枝菌丝构成；无 色或有明亮的颜色色或有明亮的颜色, ,一部分埋伏型一部分埋伏型, ,一部分气生型一部分气生型 。 曲霉属曲霉属 2 2、产孢结构、产孢结构 分生孢子梗大都

5、无横隔分生孢子梗大都无横隔, ,光滑、粗糙或有麻点。光滑、粗糙或有麻点。 梗的顶端膨大形成梗的顶端膨大形成棍棒形棍棒形、椭圆形椭圆形、半球形半球形或或球形球形 的顶囊的顶囊, ,在顶囊上生出一层或二层小梗在顶囊上生出一层或二层小梗, ,双层时下面双层时下面 一层为梗基一层为梗基, , 每个梗基上再着生两个或几个小梗。每个梗基上再着生两个或几个小梗。 从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子；从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子； 由顶囊、由顶囊、 小梗以及分生孢子链构成一个头状小梗以及分生孢子链构成一个头状 体的结构体的结构, ,称为称为分生孢子头分生孢子头。分生孢子头有各种不。分生孢子头有各种不

6、 同颜色和形状同颜色和形状 , ,如如球形、放射形、棍棒形球形、放射形、棍棒形或或直柱形直柱形 等。等。 曲霉属曲霉属 黄曲霉黄曲霉 构巢曲霉构巢曲霉 黄曲霉黄曲霉 黄曲霉黄曲霉 黑曲霉黑曲霉 烟曲霉烟曲霉 青霉属青霉属 本属产毒霉菌本属产毒霉菌, ,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧 青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰 岛青霉和皱褶青霉等。岛青霉和皱褶青霉等。 这些霉菌的代谢产物为黄绿青这些霉菌的代谢产物为黄绿青 霉素、桔青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素霉素、桔青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素 、

7、黄天精、黄天精、 环氯素和皱褶青霉素。环氯素和皱褶青霉素。 1 1、营养菌丝体、营养菌丝体 呈无色、淡色或鲜明的颜色呈无色、淡色或鲜明的颜色, ,具横隔具横隔 , , 或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型 。气生菌丝。气生菌丝 密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。 2 2、产孢结构、产孢结构 分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出, ,稍垂直于稍垂直于 该菌丝该菌丝( (除个别种外除个别种外, ,不象曲霉那样生有足细胞不象曲霉那样生有足细胞),),单独单独 直立或作某种程度的集合及至密集为一定的菌丝束直立或作

8、某种程度的集合及至密集为一定的菌丝束, , 具横隔具横隔, , 光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮, , 称为帚状枝。称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统 构成构成, ,对称或不对称对称或不对称, ,最后一级分枝即产生孢子的细胞最后一级分枝即产生孢子的细胞 , ,称为小梗。称为小梗。 青霉菌青霉菌 镰刀菌属镰刀菌属 本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰 刀菌、雪腐镰刀菌、刀菌、雪腐镰刀菌、 三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟 枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄

9、病镰刀菌和木贼镰刀菌枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌 等。等。 这些霉菌的代谢产物为单端孢霉烯族化合物、玉米赤这些霉菌的代谢产物为单端孢霉烯族化合物、玉米赤 霉烯酮和丁烯酸内酯等。霉烯酮和丁烯酸内酯等。 1 1、营养菌丝体、营养菌丝体 气生菌丝发达高气生菌丝发达高 0.50.51.0cm1.0cm或较低为或较低为 0.30.3 0.5cm0.5cm，或更低为，或更低为0.10.10.2cm0.2cm；稀疏的气生菌；稀疏的气生菌 丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出 黏孢层，内含大量的分生孢子。黏孢层，内含大量的分生孢子。 2 2、产

10、孢结构、产孢结构 可产生大、小两种分生孢子。可产生大、小两种分生孢子。 小型分生孢子小型分生孢子通常假头状着生通常假头状着生, ,较少为链状着生较少为链状着生, ,或者假头或者假头 状和链状着生兼有。状和链状着生兼有。 小型分生孢子生于分枝或不分枝的小型分生孢子生于分枝或不分枝的 分生子梗分生子梗 上上, ,形状多样形状多样, ,卵形、梨形、椭圆形、长椭圆形卵形、梨形、椭圆形、长椭圆形 、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形 等。等。1 12(3)2(3)隔隔, , 通常小型分生孢子的量较大型分生孢子通常小型分生孢子的量较大型分生孢

11、子 为多。为多。 大型分生孢子大型分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生 孢子座上孢子座上, ,或产生在粘孢团中或产生在粘孢团中; ;大型分生孢子形态多样大型分生孢子形态多样, ,镰镰 刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、 鳗鱼形鳗鱼形, ,弯曲、直或近于直。顶端细胞多种形态弯曲、直或近于直。顶端细胞多种形态, ,短啄形、短啄形、 锥形、钩形、线形、柱形锥形、钩形、线形、柱形, ,逐渐变窄细或突然收缩。逐渐变窄细或突然收缩。 蓝色犁头霉蓝色犁头霉 镰刀菌镰刀菌 链格孢霉菌链格孢霉菌 瓶

12、霉菌瓶霉菌 三、实验器材三、实验器材 样品：小麦、玉米、黄小米、面粉、米粉、面样品：小麦、玉米、黄小米、面粉、米粉、面 包、饼干、花生等包、饼干、花生等 察氏培养基、高盐察氏培养基察氏培养基、高盐察氏培养基,PDA,PDA培养基培养基, ,无无 菌生理盐水、乳酸石炭酸棉蓝染色液菌生理盐水、乳酸石炭酸棉蓝染色液 培养皿、试管、锥形瓶、镊子、玻璃涂棒、显培养皿、试管、锥形瓶、镊子、玻璃涂棒、显 微镜、盖玻片、载玻片、解剖针、酒精灯、接微镜、盖玻片、载玻片、解剖针、酒精灯、接 种钩、接种针种钩、接种针 四、实验步骤四、实验步骤 （一）产毒霉菌的分离（一）产毒霉菌的分离 按按GB/T4789.15-2

13、003 方法进行分离方法进行分离 方法一方法一 稀释平板法稀释平板法 1 1、检样的前处理及梯度稀释、检样的前处理及梯度稀释 25g检样检样 放入研钵磨碎放入研钵磨碎 （可先加少量无可先加少量无 菌生理盐水菌生理盐水） 2 2、取、取1010-1 -1、 、1010-2 -2、 、1010-3 -3三个稀释度涂布平板， 三个稀释度涂布平板， 静置静置5min5min后倒置于温箱后倒置于温箱28-3028-30培养培养3-53-5天。天。 方法二方法二 点种法点种法 1.1.采样采样 在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品 250250500g500g，尽快

14、检验。，尽快检验。 2.2.表面除菌表面除菌 如为粮粒样品，取粮食样品如为粮粒样品，取粮食样品101020g20g，放人灭，放人灭 菌的菌的 150ml 150ml 三角瓶中，无菌加入无菌水超过样面三角瓶中，无菌加入无菌水超过样面 1 12cm2cm左右，塞好塞子充分振摇左右，塞好塞子充分振摇1 12min2min，将，将 水倒净后，将粮粒倒于无菌平皿中备用水倒净后，将粮粒倒于无菌平皿中备用. . 3.3.接种与培养接种与培养 用无菌镊子将已处理好的用无菌镊子将已处理好的粮粒胚部向下粮粒胚部向下，均匀地，均匀地 插种在插种在高渗察氏平板高渗察氏平板或或PDAPDA培养基平板培养基平板上上( (

15、粮粒的一粮粒的一 部分插入培养基中部分插入培养基中) )，小粒样品如大米接种，小粒样品如大米接种 10 10 粒粒 皿，大皿，大 粒的样品粒的样品( (玉米、大豆等玉米、大豆等) )接种接种5 5粒，粒，每份样品共接种每份样品共接种 5 5个平板个平板, ,将种有样品的平皿置将种有样品的平皿置25252828孵箱培养孵箱培养5 5 7 7天，培养后期应每天观察菌落生长情况，以免生长天，培养后期应每天观察菌落生长情况，以免生长 较快的霉菌将其他的菌覆盖，影响观察及检验结果较快的霉菌将其他的菌覆盖，影响观察及检验结果 。 4 4、镜检与初分离、镜检与初分离 镜检镜检 用接种钩在平皿上钩取一小块稍带

16、少用接种钩在平皿上钩取一小块稍带少 许培养基的培养物，放在已滴加许培养基的培养物，放在已滴加 1 12 2 滴乳酸苯滴乳酸苯 酚液的载玻片上，再用二支接种钩轻轻地将培养酚液的载玻片上，再用二支接种钩轻轻地将培养 物分开，物分开， 然后盖上盖玻片，然后盖上盖玻片， 先在低倍镜下找到先在低倍镜下找到 培养物，培养物， 再将显微镜的聚光器位置降低，光圈再将显微镜的聚光器位置降低，光圈 调小，转至高倍镜下观察。调小，转至高倍镜下观察。 采用点植法采用点植法 选择适合的琼脂平板，左手拿起平板底，使培养选择适合的琼脂平板，左手拿起平板底，使培养 基朝下，右手持接种针，蘸取少量孢子点种在培养基基朝下，右手持

17、接种针，蘸取少量孢子点种在培养基 中心点或成三角形的三分点，然后盖上平皿盖，始终中心点或成三角形的三分点，然后盖上平皿盖，始终 保持平板底朝上，放于孵箱中培养；这种方法可避免保持平板底朝上，放于孵箱中培养；这种方法可避免 霉菌孢子散落在培养基上，使菌落生长一个或三个扇霉菌孢子散落在培养基上，使菌落生长一个或三个扇 形的典型菌落，便于观察。形的典型菌落，便于观察。 初分离初分离 将它们分别转种于相应的察氏培养基或将它们分别转种于相应的察氏培养基或PDAPDA培培 养基的平板，养基的平板，25252828孵箱培养孵箱培养5 51414天。天。 （二）产毒霉菌的鉴定（二）产毒霉菌的鉴定 1 1、观察

18、、观察各产毒霉菌的菌落特征各产毒霉菌的菌落特征 (1)(1)菌落生长的速度菌落生长的速度 用培养一定天数的菌落直径大小来表示霉菌生长的速用培养一定天数的菌落直径大小来表示霉菌生长的速 度。度。 (2)(2)菌落的颜色菌落的颜色 霉菌菌落的颜色应包括菌落表面的颜色；菌落背霉菌菌落的颜色应包括菌落表面的颜色；菌落背 面的颜色；菌落周围培养基的颜色面的颜色；菌落周围培养基的颜色( (是否仅限于培养基是否仅限于培养基 覆盖的部分或扩散于更大范围覆盖的部分或扩散于更大范围) )；以及霉菌在不同生长；以及霉菌在不同生长 阶段的颜色变化阶段的颜色变化( (包括表面和背面包括表面和背面) )。 (3)(3)菌

19、落的质地菌落的质地 由于菌丝的长短和疏密，以及孢子的有无和由于菌丝的长短和疏密，以及孢子的有无和 多少，菌落的质地可为绒状，絮状，绳状和束状多少，菌落的质地可为绒状，絮状，绳状和束状 。 (4)(4)菌落的表面菌落的表面 疏松或致密；平坦、凹陷或隆起，有无皱褶疏松或致密；平坦、凹陷或隆起，有无皱褶 ，有无放射状或同心环状的沟纹，边缘是否整齐，有无放射状或同心环状的沟纹，边缘是否整齐 等。等。 (5)(5)渗出物渗出物 有的菌种常常在菌落表面出现的带颜色的似有的菌种常常在菌落表面出现的带颜色的似 液体物即为渗出物，记录其色调和分泌的量。液体物即为渗出物，记录其色调和分泌的量。 (6)(6)其他其

20、他 是否出现除霉味以外的其他特殊的气味。是否出现除霉味以外的其他特殊的气味。 2 2、观察各产毒霉菌的镜下特征、观察各产毒霉菌的镜下特征 将生长茂盛的菌丝用乳酸石炭酸棉蓝染液将生长茂盛的菌丝用乳酸石炭酸棉蓝染液 做压滴标本镜检以鉴定到属或种。做压滴标本镜检以鉴定到属或种。 主要镜检以下特征：主要镜检以下特征： （1 1）各产毒霉菌的菌丝结构，有无隔膜；）各产毒霉菌的菌丝结构，有无隔膜； （2 2）各产毒霉菌各产毒霉菌产孢结构的形态特征；产孢结构的形态特征； （3 3）各产毒霉菌各产毒霉菌分生孢子的形态及排列等特分生孢子的形态及排列等特 征。征。 五、实验结果 根据菌落形态及镜检结果根据菌落形态

21、及镜检结果, ,参照各种霉参照各种霉 菌的形态描述及检索表菌的形态描述及检索表, ,确定菌种名称。确定菌种名称。 一、实验目的一、实验目的 1 1 、学习并掌握食品中常见产毒霉菌分离、学习并掌握食品中常见产毒霉菌分离 纯化的主要方法和技术纯化的主要方法和技术; ;进一步熟练掌握进一步熟练掌握 食品检样的处理及梯度稀释技术；食品检样的处理及梯度稀释技术； 2 2 、掌握产毒霉菌的形态学鉴定技术，了、掌握产毒霉菌的形态学鉴定技术，了 解菌丝形态及其产孢结构在霉菌分类鉴解菌丝形态及其产孢结构在霉菌分类鉴 定中的重要性；定中的重要性； 二、实验原理二、实验原理 产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类

22、食产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类食 品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半 知菌亚门中的知菌亚门中的曲霉属曲霉属、青霉属青霉属和和镰刀菌属镰刀菌属。其产生的。其产生的 毒素主要毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、 烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏 马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。 霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌产毒的条件霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌产毒的条件 主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及 空气的流通情况空气的流通情况 。 1 1、营养菌丝体、营养菌丝体 呈无色、淡色或鲜明的颜色呈无色、淡色或鲜明的颜色, ,具横隔具横隔 , , 或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型 。气生菌丝。气生菌丝 密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。密毡状、松絮状或部分