人用HN禽流感疫苗免疫动物效果观察

1、人用H5N1禽流感疫苗免疫动物效果观察作者：朱智勇，丁晓航，朱函坪，李岩金，陈学奎，沈吉友，张涛，何培江，姚縻苹苹，徐芳，翁景清，龚华袼岳，郭志军，苏波，孙淑滨雀，梁伟峰【关键词】禽流噩感疫苗；免疫动物;中和抗悍体；效力试验摘要：目的将用禽流感毒种R12钉03株按3种生产工艺生产的疫苗进行动物接种,观察缚疫苗的免疫效果。方法用不同剂量的3种工艺生产的禽流感疫苗，分别免疫大汪鼠和家兔，肌肉接种2针，披首针后14和28d静脉采血，测定接种1针和2针后踹，动物血清中血凝抑制抗体账和中和抗体的产生情况。结氓果大鼠的抗体反应较家兔敏感；大鼠和家兔在疫苗无接种1针后14d,都能产鄄生血抑抗体,滴度可达1喾

2、40,但中和抗体滴度都很吮低,几乎测不到；接种2针后,血抑抗体或中和抗体反铵应都显著高于第1针；裂解乇-2苗接种大鼠和家兔后的机抗体反应普遍高于另2种疫萁苗,且家兔量-效反应明显伺。结论裂解-2疫苗优匣于其他2种；中和抗体能正印确反应疫苗的质量；H5N焰1禽流感疫苗的效力试验可胱用于免疫家兔测定中和抗体倾和临床前研究的动物试验，用15g血凝素(HA)接种家兔2针，血清中和抗体滴度达1:40或以上。漩关键词：禽流感疫苗；免脸疫动物;中和抗体；效力试验Observatio枯noneffectofa艋vianinfluenz霉a(H5N1)vacci氅newithimmunizationanimal

3、蛎sAbstract：Objective撸Thevaccinesp鳐roducedaccor鲒dingtothethreetechniques藓withthevirus肚seedsR1203of蚰H5N1avianinf潲luenzawereus妒edtoimmunize栈animalsandtoobservethe烁Ratsandrabbi澌tswereimmuni徉zedwiththedifferentdoseo正fthethreevac苔cinesofavian亿influenza(H5谖N1)byanintramuscularinje伫ctiontwice(i逦nterval14day

4、砻s).Bloodwasc德ollectedintr檫avenouslyint圩hedayof14and署28.Thehemagg氯lutinationin质hibitionanti鲒bodyandneutr敖alizationant郝ibodyoccurre足dintheserumo伤ftheanimalsa冼fterthefirst旧andsecondT盼heantibodyreactioninther瘢atswasmoresensitivethant匾herabbits.Theratsandrabb旒itsbothcould棰producehemag碳glutinationi后nhibi

5、tionantibodyin14thd楣aywiththetit意eroftheantibodyreachingat1:40whilethetiterofthen袄eutralizatio纣nantibodywas锪verylowandha尝rdlydetected蝽.Thesecondin庸oculationwer卵esignificant蝾lyhigherthan襞thefirstinoc古ulation.Thea劐ntibodyreactionafterinoc呐ulationofthesplit2vaccineintheratsan遍drabbitswere痄significantl滩

6、ystrongertha轳nthatinocula柝tedwithanothertwovaccine唳s.Thequantum摞effectreactionwasdistinc莞tintherabbit塘s.Conclusion捐Theproduct瞟iontechnique肮ofsplit2vacc塄inewasbetter苍thantheother癜two.Theneutr豸alizationantibodycanaccu恚ratelyreflec册tthequalityo纩fvaccines.Th熬eefficiencyt哎estshouldbea苏ddedinvaccinesresea

7、rchan框dproductionw棰iththemethod丁ofimmunerabb晖its.Itissugg艿estedtoimmun狄izerabbitstw厘icewith12gHAwiththetite膣roftheseraneutralization雄antibodyreac奏hingat1:40oroverinanimal蕃testbeforecl胂inicaltrial.Keywords：avianinfluenzav野accine;immun购eanimal;neutralizationantibody;efficiencytest前期禽流感疫苗毒种的检定及毒种库的建立研究

8、结果表明，引进的2株H5N1琦禽流感毒种R1194和R垡1203均可用于疫苗的生叠产。最初用R1194株，裤按XX年中国药典三部制造流感全病毒疫苗的规程1，生产一批全病毒疫鎏苗，进行接种动物的预备试磴验取得一定效果。XX年底泥，国内外禽流感疫苗研究有谷了新的进展，特别是在疫苗剃中加入佐剂，使有效接种剂酪量不断降低。又根据禽流感苗疫苗生产的工艺设计及检定肯研究结果，设计3种生产疫哺苗的纯化工艺，用R119昱4株或R1203株都能生坎产出高质量的疫苗，但R1抽203株生产疫苗的产量较质R1194株高，因此，在正式试验时我们确定用R1203毒种生产的3种疫苗，进行动物接种，观察它们去的免疫效果。结果

9、报告如下钣。1材料与方法1睹1毒种H5N1禽流感毒种R1194(英国崛国家生物制品检定所)和R劭1203株(美国疾病控制中心)。12疫苗(1)用R1194毒株降，按中国药典三部XX皱版流感全病毒灭活疫苗的方法制备(批号XX1201剁)1。(2)用R1203毒种，按本研究第2部鼐份制订的生产工艺生产的3种疫苗：全病毒疫苗，裂解达-1疫苗，裂解-2疫苗。13动物大鼠：远SD种群，4550g。笞家兔：新西兰种群，20厨25kg。小鼠：昆明种群筱，1820g(浙江省动郛物中心)。鸡:三黄鸡，1520kg(浙江慈溪养攴鸡场)。14佐剂羲氢氧化铝(浙江天元生物药业公司)。15动雩物免疫预备试验用不同夭剂量

10、的血凝素(HA)，采淼用大剂量的试验方案：(1)疫苗：R1194株制备遒的全病毒疫苗。(2)动物骷：家兔，小鼠，鸡。(3)苹佐剂：氢氧化铝，有或无。钩(4)剂量：30,60,硕90g/只，0，14d刭2针。(5)接种途径：肌且肉，皮下。16动物暌免疫正式试验(1)毒赧种：R1203；(2)疫个苗：全病毒疫苗、裂解-1澡疫苗、裂解-2疫苗3种；陧(3)动物：大鼠(每组1躇0只)，家兔(每组45只)；(4)佐剂：氢氧化铝；(5)接种途径：肌肉叩；(6)剂量(HA)：0吝75,15,30,60,痛120g/只,0，14份d2针；后又在家兔组中,墚用裂解-2疫苗,增加30咭和45g2组；(7)血鄹抑试

11、验用的血凝素为R11瞰94株，中和试验用的攻击呢毒株为R1194株。首针舳和加强接种前当天及加强接新种后14d，各静脉采血1锺次，共3次，分离血清，-30以下冻存。17莶血抑抗体检测按常规訾法，抗原为R1194或R涌1203的血凝素。18讨中和抗体检测在蛋胚中测定，固定病毒，稀释求血清，等量混合，37中克和90min，每只鸡蛋接哎种鸡胚感染剂量100(E硐iD50)。2结果21动物免疫预备试验衽(1)敏感性为家兔小鼠鸡。(2)佐剂苗的鄣免疫效应优于无佐剂苗。(湄3)剂量之间(30,60辞,90gHA)测得的中追和抗体或血抑抗体量-效反菁应不明显。(4)肌肉接种兔的免疫效应优于皮下接种。拔(5)

12、血抑抗体或中和抗体琥,2针高于1针。图1蜣大鼠和家兔不同剂量接种1针和2针后血抑抗体滴度图2大鼠和家兔不同剂馔量接种2针后中和抗体滴度扫22动物免疫正式试舴验(图1，2)根据对规免疫动物血清抗体的检测结驿果：(1)大鼠和家兔免前缵血清中，未检出H5N1血抑抗体和中和抗体。(2)鲢大鼠对禽流感病毒敏感性高于家兔，但大鼠过于敏感。(3)第1针后14d，3尜种疫苗各剂量组的血抑抗体腆大部分达到140或以上檎，但中和抗体都很低。(4晕)2针后14d，血抑抗体嵋和中和抗体明显升高，但血抑抗体量-效反应不明显，而裂解-2疫苗的中和抗体楔量-效反应明显。(5)裂解-2疫苗接种大鼠和家兔锦的抗体反应，普遍高于

13、另2默种疫苗。23各型流感病毒和各型流感抗血清交叉中和试验结果(表1)。表1各型流感病缺毒和各型流感抗血清交叉中和试验注：A为甲型流感阉病毒HINI；A3为甲型像流感病毒H3N2；B为乙睁型流感病毒；A5为禽流感汴病毒R1194从堍表1可知，各型流感抗血清申仅能中和同型病毒。鸡胚病埸毒中和试验判断结果客观、洌重复性好，试验结果基本相幂似。3讨论一般认煎为，由于H5N1禽流感病骠毒过去未在人群中发生流行，人体普遍无它的抗体，因鹂而首次免疫所需的抗原量必粼须很大，故John等禽流散感疫苗的人体观察结果，需郎要接种90g2针才有效李2，此剂量超出普通流感疫苗剂量15g1针的暧12倍。然而随着研究的深

14、碣入，发现在疫苗中加入佐剂兵，可显著提高免疫效果，疫圬苗免疫的有效剂量，从最早娶的90g2针立即降至3锕0g2针3，以后又堍降至15g2针4，10g2针5，直至触38g2针6。从禽乔流感疫苗研究的进展可知，变化的是剂量不断降低，但霈不变的是必须接种2针，这晒恰恰反应疫苗免疫接种的一拣般规律，即机体抵御新的抗原作出有效的反应，必须要谍多次接触才能完成。本研究嘟发现，疫苗接种大鼠和家兔潭1针后14d，大鼠和家兔庆动物都能产生血抑抗体，滴掸度也可达140或以上，但中和抗体滴度都很低，几乎测不到。本研究发现，普喝通流感和禽流感的血抑试验晨相互之间都有交叉反应，而踬单扩试验和中和试验则无交叉。可以认为，

15、接种1针后，动物产生低滴度的血抑抗谴体可能是非特异的或无中和珞病毒能力的，又因为血抑试验本身存在很多问题7，影响因素多，方法不稳定斑，故用血抑抗体作为指标，不能正确反应疫苗的质量，咋必需观察中和抗体。普通流穹感疫苗的生产规程中，没有效力试验这一项，生产厂家拿到WHO推荐的生产毒株或类似株，不管是否做过临决床试验就可生产，这是不科学的。临床试验应该包括3牒方面的内容，副反应、产生嫘中和抗体的有效剂量和与其他型别的相互干扰。在目前挞研究中的禽流感疫苗，应该蛄考虑增补效力试验，而且必料须做病毒中和试验。本文研究结果表明，免疫家兔产生溢禽流感病毒的中和抗体量-效反应明显。又证明各型流驵感病毒和各型流感

16、抗血清没尸有交叉，且方法稳定，判断扬客观，重复性好，因而提出糖禽流感疫苗的研究和生产必并须有效力试验。建议合格标籽准：(1)临床前动物试验裹中，要求用15gHA接酴种家兔1针，血清中和抗体岢滴度均达140或以上。于(2)在临床试验时，要求拿人体接种不同剂量疫苗2针缑后，血清中和抗体滴度达1司40或以上，定为抗体阳踅转。(3)在疫苗生产、检腑定规程中，要求疫苗的血凝素(HA)剂量为临床试验闹时接种者抗体75%阳转的剂量。本研究用R1203逛毒种，按3种不同工艺生产荇的疫苗，接种家兔和大鼠，均出现裂解-2疫苗的抗体来反应较强，并超过全病毒疫苗，这似乎不好理解。现已崾知，抗体反应强弱与抗原量霏和抗原

17、颗粒大小密切相关。偾从3种不同工艺生产疫苗的拖电镜形态观察可知，裂解-1疫苗，抗原颗粒虽多，却猛太细，妨碍它的免疫原性，靛再看裂解-2疫苗，由于裂渔解后的颗粒较大，因而可能仍有较好的免疫源性，且抗爻原颗粒数目远超过全病毒苗客。再从电泳图看到，裂解-才2疫苗的蛋白条带和全病毒弛疫苗没有差别，这些可能是馍它效果好的原因。参考文献1国家药典委莹员会.生物制品生产和核定用菌种、毒种管理规程S浔.中华人民共和国药典夜三部.北京：化学工业出琥版社，XX：3-9.师2JohnJ,TreanorMD,Jame嫡sD,etandimmu湃nogenicityof疰aninactivate唼dsubvirioninfluenzaA(H5N碣1)vaccineJ伲.NEnglJMed,X曾X,354(13)：13腚43-1351.3BressonJL,赛PerronneC,La丧unayO,etandi殇mmunogenicityofaninactiv戎atedsplit-vi嫁rionifluenza棼A/Vietnam/1194/XX(H5N1)v蓍accine：phase菪Irandomisedt龙rialJ.Lanc诃et，XX,367(95僻23)：1657-166癍4.4世界卫生搋组织(WHO).大流行流感疫苗法规指南EB/O绩L.http/SHW/svdocs/562711c4