药基基因工程课件

1、1 基因工程技术基因工程技术 (Genetic engineering) 药基基因工程2 2. 2. 基因工程（基因工程（genetic engineeringgenetic engineering）：在分）：在分 子水平上用人工方法提取或制备子水平上用人工方法提取或制备DNADNA，在体外切，在体外切 割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把 重组的重组的DNADNA分子导入受体细胞，使外源分子导入受体细胞，使外源DNADNA在受体在受体 细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同 的蛋白产物或定向的创造生

2、物的新性状，并使之的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之 稳定的遗传给子代。稳定的遗传给子代。 一、基本概念一、基本概念 1. 1. 基因（基因（genegene）：是生物体传递遗传信息和表）：是生物体传递遗传信息和表 达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功 能的蛋白质或能的蛋白质或RNARNA所必需的全部核苷酸序列。所必需的全部核苷酸序列。 药基基因工程3 l分：目的基因的获取、载体的选择分：目的基因的获取、载体的选择 l切：限制性内切酶的应用切：限制性内切酶的应用 l接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体接：用连接酶将目的基因和载体连接重组

3、体 l转：将重组体导入到受体细胞转：将重组体导入到受体细胞 l筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克 隆隆 l表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物 二、基因工程的基本程序：二、基因工程的基本程序： 分、切、接、转、筛、表分、切、接、转、筛、表 药基基因工程4 GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG 表表 药基基因工程5 三、基因工程实验特点及要求三、基因工程实验特点及要求 l1. 微量操作微量操作 l 2. 连续性操作

4、连续性操作 l 3. 低温操作低温操作 l 4. 防止污染（杂质污染、细菌污染）防止污染（杂质污染、细菌污染） l 5. 实验物品切忌乱扔乱丢实验物品切忌乱扔乱丢 l 6. 认真写好实验纪录认真写好实验纪录 药基基因工程6 l第一次实验第一次实验: : 质粒质粒DNADNA大量制备、浓度分析大量制备、浓度分析 l第二次实验：第二次实验：DNADNA限制性内切酶消化、电泳、片段限制性内切酶消化、电泳、片段 回收、重组连接回收、重组连接 l第三次实验：重组质粒的转化、第三次实验：重组质粒的转化、 PCRPCR l第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNADNA小量快速小

5、量快速 制备）、杂交制备）、杂交 l第五次实验：显色、考试第五次实验：显色、考试 药基基因工程7 实验一实验一 质粒质粒DNADNA大量制备、浓度及纯度分析大量制备、浓度及纯度分析 l目的：获得高浓度、高纯度的质粒目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNADNA。为。为 酶切和基因转染作准备。酶切和基因转染作准备。 质粒质粒 （plasmidplasmid）：）：存在于细菌染色体存在于细菌染色体 外的环状双链外的环状双链DNA,DNA,能在宿主细胞内独立自主能在宿主细胞内独立自主 复制；带有某些遗传信息复制；带有某些遗传信息, , 会赋予宿主细胞会赋予宿主细胞 一些遗传性状。一些遗传性状。 药基基因

6、工程8 药基基因工程9 载体的选择标准载体的选择标准 l能自主复制；能自主复制； l具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； l有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单 一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点； l分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。 药基基因工程10 药基基因工程11 基本步骤：基本步骤： l细菌的生长和质粒的扩增细菌的生长和质粒的扩增: : 将表达质将表达质 粒粒DNADNA的活细菌进行大量培养。的活细菌进行大量培养。 l细菌的采集和裂解细菌的采集和裂解

7、, ,抽提质粒抽提质粒DNADNA： 碱变性法提质粒碱变性法提质粒 ； l质粒质粒DNADNA的提纯的提纯: :除蛋白质、除蛋白质、RNARNA和与质粒和与质粒 DNADNA分子量相近的断裂染色体分子量相近的断裂染色体DNA DNA 。 药基基因工程12 碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNA原理：原理： l利用质粒利用质粒DNADNA与染色体与染色体DNADNA分子大小不同，变性和分子大小不同，变性和 复性的差异。复性的差异。 l在在pH=12.6pH=12.6的的NaOH-SDSNaOH-SDS环境下，质粒环境下，质粒DNADNA与染色体与染色体 DNADNA的氢键均破坏，但是染色体的氢键均破

8、坏，但是染色体DNADNA断裂成线状，断裂成线状， 而质粒而质粒DNADNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pHpH 调整到调整到7.07.0，质粒，质粒DNADNA复性存在溶液中，而染色体复性存在溶液中，而染色体 DNADNA不能复性与变性的蛋白质、不能复性与变性的蛋白质、SDSSDS相互缠绕形成相互缠绕形成 沉淀，经离心被分离。沉淀，经离心被分离。 药基基因工程13 质粒质粒DNA的纯化：的纯化： l蛋白质的清除：蛋白质的清除：蛋白质的变性剂蛋白质的变性剂酚和氯仿酚和氯仿. . lRNARNA的清除：的清除：RNARNA酶消化；酶消化；LiClLiCl沉淀沉

9、淀; ;层析层析。 l与质粒分子量相近的线状断裂的染色体与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNADNA 的清除：的清除：等体积等体积1.6mol/L NaCl , 13%PEG; CsCl1.6mol/L NaCl , 13%PEG; CsCl 梯度超速离心等梯度超速离心等。 药基基因工程14 CsCl密度梯度超速离心法：密度梯度超速离心法： lCsClCsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心 后，形成浓度梯度，当后，形成浓度梯度，当DNADNA的沉降速度与扩散速度达到的沉降速度与扩散速度达到 平衡时，染色体平衡时，染色体DNADNA、质

10、粒、质粒、RNARNA等各分离颗粒，在密度等各分离颗粒，在密度 梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依 据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。 EBEB是一种丫啶类染料，可嵌入双链是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNADNA的碱基之间，使的碱基之间，使 DNADNA的解旋体积增大，浮力密度变小。的解旋体积增大，浮力密度变小。EBEB与环状质粒与环状质粒DNADNA 的结合量小于线状染色体的结合量小于线状染色体DNADNA的结合量，故质粒的结合量，故质粒DNADNA的浮的浮 力密度大与

11、线状染色体力密度大与线状染色体DNA,DNA, 位于离心管的下层。位于离心管的下层。RNARNA总总 是与是与Cs+Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。结合，密度最大，超离时位于管底。 药基基因工程15 Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）柱层析法（琼脂糖凝胶柱） l利用分子筛效应，分子量大的分子不能利用分子筛效应，分子量大的分子不能 进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流 出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经 内，流程长，后流出来。质粒内，流程长，后流出来。质粒DNADNA分子分子 量大于量大于RNARNA，故先洗脱

12、下来。，故先洗脱下来。 药基基因工程16 LiClLiCl沉淀法：沉淀法：Li+Li+可与可与RNARNA结合，形成锂结合，形成锂 盐沉淀，而盐沉淀，而DNADNA不与锂结合，故经离心不与锂结合，故经离心 可将二者分离。注意在变性阶段，操作可将二者分离。注意在变性阶段，操作 要温柔，不要使染色体要温柔，不要使染色体DNADNA断裂。断裂。 聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状只沉淀环状DNADNA 药基基因工程17 操作步骤操作步骤: 收集细菌收集细菌 GET 悬浮悬浮 SDS-NaOH pH=12.6 碱变性碱变性 KAc pH=4.8 质粒质粒DNA完全复性完全复性 染色体染色体DN

13、A不能复性不能复性 离心离心 上清上清: 质粒质粒,小分子小分子RNA, 少量蛋白质少量蛋白质 沉淀沉淀: 染色体染色体DNA, 大分子大分子RNA , SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物 取上清取上清, 加等体积异丙醇加等体积异丙醇 沉淀沉淀DNA(缩小体积缩小体积) 离心离心 沉淀溶于沉淀溶于TE 等体积等体积LiCl 药基基因工程18 沉淀沉淀RNA 离心离心 加等体积酚加等体积酚 氯仿异戊醇氯仿异戊醇 去杂蛋白去杂蛋白 离心离心,取上取上 层水相层水相 酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇 重复一次重复一次 离心离心,取上取上 层水相层水相 2 2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇 0.1体积体积NaAc

14、 沉淀沉淀DNA 离心离心 70%乙醇乙醇 清洗沉淀清洗沉淀 晾干晾干 TE(50ul)溶溶 解沉淀解沉淀 取取5ul电电 泳鉴定泳鉴定 取上清取上清, 加等体积加等体积 异丙醇沉淀异丙醇沉淀 DNA(缩小体积缩小体积) 离心离心 沉淀溶于沉淀溶于 500ul TE， RNA酶消化酶消化 30min 药基基因工程19 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离片段的琼脂糖凝胶电泳分离 l原理以琼脂糖为电泳支持物，原理以琼脂糖为电泳支持物，DNADNA因分子大小、形状、构象不同，因分子大小、形状、构象不同， 在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNADNA可与

15、荧光染料可与荧光染料 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。 DNADNA 可与荧光染料可与荧光染料GoldviewGoldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条 带。带。 。 l琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处 理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-9998-99），近似自由电），近似自由电 泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨泳，样品扩散较

16、自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨 率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用 字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定， 制成干膜可长期保存。制成干膜可长期保存。 药基基因工程20 DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：的琼脂糖凝胶电泳影响因素： l1. 1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比， 但当但当20kb20kb时，迁移率不在依赖于分子大小；时，迁移率不在依赖于分子大小； l2. 2.

17、 核酸构型核酸构型: :分子量相同的情况下，共价闭环分子量相同的情况下，共价闭环 DNADNA直线直线DNADNA开环环状开环环状DNA DNA l3.3.与凝胶浓度关系与凝胶浓度关系: :一定大小的一定大小的DNADNA在不同凝胶浓在不同凝胶浓 度中迁移率不同；度中迁移率不同； l4.4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电 压（压（5v/cm 2.0 DNA: OD260nm OD280nm = 1.7 1.7, RNA污染污染 1.7, 蛋白质污染蛋白质污染 药基基因工程22 结果分析：结果分析： 线状线状DNA 超螺旋超螺旋DNA 药基基因工

18、程23 第二次试验：构建重组第二次试验：构建重组DNA l载体的酶切消化载体的酶切消化 l酶切产物琼脂糖凝胶电泳酶切产物琼脂糖凝胶电泳 lDNADNA片段回收片段回收 l目的基因、载体重组连接目的基因、载体重组连接 药基基因工程24 一、质粒一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解的限制性内切酶消化酶解 l原理原理 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction enzymerestriction enzyme）是）是 细菌体内含有的一类能特异识别双链细菌体内含有的一类能特异识别双链DNADNA分子的特分子的特 定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有

19、三 类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限 制性无修饰性，不需要制性无修饰性，不需要ATPATP，实用性大，是基因工，实用性大，是基因工 程常用工具酶之一。程常用工具酶之一。 l作用：作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系 统，限制外源统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。 l其识别序列特点及酶切产物：其识别序列特点及酶切产物：4-6bp4-6bp，回文结构；，回文结构； 粘性末端或平端粘性末端或平端 药基基因工程25 GTC CAG G CCTAG GATCC G GGATCC CCTAGG GTCG

20、AC CAGCTG GAC CTG 药基基因工程26 l命名方式（以命名方式（以Hind III为例）：为例）： 属：属： HHaemaphilus 种：种： ininfluenza 株：株： d株株 编号：编号： 药基基因工程27 同功异源酶同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bst 药基基因工程28 同尾酶同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内

21、切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端， 称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为。这两个相同的粘性末端称为配配 伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G A TCTAG GATCT A 药基基因工程29 l限制性内切酶（）单位及实际用量：限制性内切酶（）单位及实际用量： 在限定的温度和反应环境中，小时消化在限定的温度和反应环境中，小时消化 1ugDNA1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原所需的酶量为一个酶单位。由于种种原

22、因，一般使用因，一般使用3-5u/ugDNA3-5u/ugDNA，延长小时以上，延长小时以上， 是酶切反应更彻底。是酶切反应更彻底。 lRERE保存条件保存条件：50%50%甘油中，用时需稀释甘油中，用时需稀释1010倍以倍以 上才能解除抑制。上才能解除抑制。 药基基因工程30 酶切系统组成及计算方法：酶切系统组成及计算方法：根据根据DNADNA量计算酶量计算酶 的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的 用量。用量。 质粒质粒DNA10ug(10ul) 1ug/ul l 10 buffer 1.5-2.5ul l RE 30-50U(1.5-2.5u

23、l) 20U/ul l d3H2O 6ul l l 总体积总体积15-25ul l 加样顺序：先加水，再加加样顺序：先加水，再加buffer和和DNA，最后加酶，最后加酶 药基基因工程31 操作步骤：操作步骤： l质粒质粒DNA 20ul ( 10ug ) l10 buffer 3 ul l Xbal 1.5 ul (30U) l Hind III 1.5ul (30U) l d3H2O 4ul l l 总体积总体积 30ul l加样，短暂离心，加样，短暂离心，370C水浴消化。水浴消化。 药基基因工程32 三、三、DNA片段回收及纯化片段回收及纯化 lDEAE纤维素膜的电泳回收方法纤维素膜的

24、电泳回收方法：紧靠目的：紧靠目的DNA 片段前方切一裂隙，将一条片段前方切一裂隙，将一条DEAE纤维素膜插入纤维素膜插入 裂隙中，继续电泳直至条带中所有的裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到均收集到 膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液 洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA 洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且 获得的获得的DNA极纯，但仅适用于小片段极纯，但仅适用于小片段DNA （15Kb的的DNA片段和单链片段和单链DNA不适合

25、，不适合， 因难以洗脱下来。因难以洗脱下来。 药基基因工程33 三、三、DNA片段回收及纯化片段回收及纯化 l透析袋电洗脱法：透析袋电洗脱法：将含有将含有DNADNA片段的凝胶切下置于充满片段的凝胶切下置于充满1xTAE1xTAE 的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上 方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE1xTAE电泳槽中，电泳槽中， 电泳电泳2-32-3小时，使小时，使DNADNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大 小范围较宽的小范围较宽的D

26、NADNA，但很不方便。，但很不方便。 l从低溶点琼脂糖凝胶中回收从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNADNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙琼脂糖的糖链上引入了羟乙 基，在基，在30300 0C C左右成胶，大约在左右成胶，大约在65650 0C C熔化，在大多数双链熔化，在大多数双链DNADNA熔熔 点温度以下。点温度以下。 l采用挖槽法采用挖槽法 l酚冻法酚冻法。 药基基因工程34 纯化：纯化： l1.DEAE1.DEAESephacelSephacel柱层析法：将带负电柱层析法：将带负电 荷的荷的DNADNA结合到一种阳离子基质上而将污结合到一种阳离子基质上而将污 染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强

27、染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强 度将度将DNA DNA 洗脱下来。洗脱下来。 l2.2.有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：用用2-2-丁醇和丁醇和酚氯酚氯 仿抽提仿抽提。 药基基因工程35 l制胶制胶 l点样点样 l电泳分离电泳分离 l回收片段回收片段 l抽提沉淀抽提沉淀DNA。 操作步骤操作步骤: 药基基因工程36 结果分析：结果分析： l分子量标准：分子量标准：噬菌体的噬菌体的DNA，全长，全长49.01kb， 经经Hind消化产生消化产生7条带，条带，23.7kb, 9.46kb, 6.75kb, 4.26kb, 2.26kb, 1.98kb, 0.58kb l完全酶解的质粒有两条带及

28、目的基因和载体，分完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，分 别为别为1.1kb和和5.4kb，应位于，应位于1.98 和和0.58kb及及 4.26-6.75kb之间之间 l溴酚蓝前的绿色带为溴酚蓝前的绿色带为RNA l若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种 构象。构象。 药基基因工程37 开环开环 线性线性 超螺旋超螺旋 药基基因工程38 marker plasmid RE digested 药基基因工程39 四、四、DNA片段的重组连接片段的重组连接 l原理原理 1.1. 在在T T4 4DNADNA连接酶的催化下，载体基因片段与连接酶的催化

29、下，载体基因片段与 目的基因片段的粘性末端共价结合目的基因片段的粘性末端共价结合, ,连接连接, ,环化成环化成 重组环状重组环状DNADNA分子。分子。 药基基因工程40 l2.2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器 l3.3.影响重组连接因素影响重组连接因素: :目的基因的浓度与载体目的基因的浓度与载体 的比例的比例(3-5:1)(3-5:1)；离子浓度；温度：；离子浓度；温度：14-1614-160 0C C。 l4.DNA4.DNA连接酶单位：用连接酶单位：用WeissWeiss单位对酶进行标化：单位对酶进行标化： 1 1个个WeissWeis

30、s单位指在单位指在37370 0C C下下2020分钟内催化分钟内催化 1nmol1nmol32 32Pi Pi从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到,-,-32 32PiATP PiATP 所需的酶量。所需的酶量。 药基基因工程41 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接 1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接 方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端连接配伍末端连接 非配伍末端连接非配伍末端连接 药基基因工程42 Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶连接酶 15C GAT

31、CC G G CCTAG 目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 载体载体DNA用用Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 重组体重组体 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 载体自连载体自连 目的基因自连目的基因自连 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 药基基因工

32、程43 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA Eco R切割位点切割位点 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A Bg l切割位点切割位点 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG EcoR+ Bg l 双酶切双酶切 Eco R+ Bg l 双酶切双酶切 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 配伍末端的配伍末端的 连接情况和同一连接情况和同一 限制酶切位

33、点连限制酶切位点连 接相似。接相似。 药基基因工程44 2. 平端连接平端连接 适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端 药基基因工程45 目的基因目的基因 载体载体 限制性内切酶限制性内切酶 限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 载体自连载体自连 目的基因目的基因 自连自连 药基基因工程46 3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作的作 用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制

34、造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。 药基基因工程47 5 3 3 5 载体载体DNA 5 3 3 5 目的基因目的基因 限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶 末端转移酶末端转移酶 + dATP 末端转移酶末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 药基基因工程48 4. 4. 人工接头人工接头(linker)连接：

35、连接： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除 产生粘性末端，而进行粘端连接产生粘性末端，而进行粘端连接。 药基基因工程49 人工接头及其应用人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5- 3- Eco R Eco R Eco R Eco R 药基基因工程50 连接体系连接体系 l目的基因： 8ul l载体质粒 2ul l10 xBuffer 1.5ul lT4 DNA连接酶 1ul l水 2.5ul 总体积： 15ul 药基基因工程51 第三次实验第三次实验 感受态细菌的制备及转化实验感受态细菌的制备及转化实验 l原理原理 l1.1.将重

36、组将重组DNADNA分子导入受体细菌中进行复制扩增，分子导入受体细菌中进行复制扩增， 再进行检测，以获得正确的阳性重组体。再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将重组将重组 DNADNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。一般一般 受体细菌对重组受体细菌对重组DNADNA分子的摄取能力很低，难以转分子的摄取能力很低，难以转 化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌 细胞对细胞对DNADNA的摄取能力大为增加，转化效率提高。的摄取能力大为增加，转化效率提高。 这种这种细菌细胞能摄取外来细菌细胞能摄取外来DNADNA的生

37、理状态称为感受的生理状态称为感受 态态，此阶段的细菌称感受态细菌。，此阶段的细菌称感受态细菌。 药基基因工程52 l2.2.感受态形成假说：感受态形成假说： 局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素 处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些 小孔，允许外来小孔，允许外来DNADNA分子进入。分子进入。 酶酶- -受体假说：用特定的化学或物理因素处理受体假说：用特定的化学或物理因素处理 细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一 些酶的位点，可以把外来些酶的位点，可以把外来DNA

38、DNA转入胞内。转入胞内。 药基基因工程53 l3.3.制备方法：制备方法： l电击法电击法: :将细菌置入一定的容器内，通入高将细菌置入一定的容器内，通入高 脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效 率高，可达率高，可达101010 10/1ugDNA /1ugDNA，但细胞容易死亡，但细胞容易死亡， 约一半以上的细胞死亡。约一半以上的细胞死亡。 l化学法：如：化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化还原剂、氯化 六氨合高钴等，成功率可达六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。 药基基因工程54 4.受体菌的改造与选择：受体菌的改造与选择：

39、l限制与修饰系统：限制与修饰系统：R-,M-R-,M-或或R-,M+R-,M+的突变体，（的突变体，（R R： restriction; M: modificationrestriction; M: modification） l重组系统：选用重组系统：选用rec+rec+的转化（提高转化效率），的转化（提高转化效率）， 再转到再转到rec-rec-受体菌中保存（防治整合到染色体受体菌中保存（防治整合到染色体DNADNA 基因组中去）。基因组中去）。 l有明显的选择性差异：例如，载体有明显的选择性差异：例如，载体Ampr, Ampr, 目的基目的基 因因StrrStrr，应选择，应选择Amps

40、 /StrsAmps /Strs的受体菌。的受体菌。 l空菌空菌 l选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌： 肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。 药基基因工程55 转化时期选择：转化时期选择： l细菌生长时相分为：静细菌生长时相分为：静 止期、对数生长期、稳止期、对数生长期、稳 定期和衰亡期。定期和衰亡期。 l转化最佳时期应选择在转化最佳时期应选择在 对数生长期的后期对数生长期的后期。 OD550nm=0.2-0.3 （5-6 108细胞细胞/ml） 药基基因工程56 5.转化：外来转化：外来DNA进

41、入细菌内部的过程。进入细菌内部的过程。 l具体过程：具体过程：a.吸附：吸附：dsDNA吸附在细菌表面；吸附在细菌表面；b.转入：一转入：一 条条ssDNA进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；c. 自稳：自稳：ssDNAdsDNA；d.复制表达复制表达 l*在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将dsDNA吸附吸附 到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子，到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子， DNA以双链进入。以双链进入。 l现选用一种常用制备感受态细菌的方法（现选用一种常用制备感受态细

42、菌的方法（CaCl2），供实验），供实验 应用。细菌在低渗的应用。细菌在低渗的CaCl2溶液中逐渐膨胀成球形，溶液中逐渐膨胀成球形，DNA 与与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，被吸附在细菌表面，形成羟基钙磷酸复合物，被吸附在细菌表面， 细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。 药基基因工程57 l操作步骤：（见讲义，穿插PCR、southern转 膜） l注意事项：1.冰浴操作，增加感受态量及延长 感受态时间。 l 2.无菌操作，防止杂菌污染。 l 3.试剂要求纯度高 l 4.重组时的高盐，在转化时要稀释 l 5.涂皿时不要来回涂布 药基基因工程58 预期结果及结果分析：

43、预期结果及结果分析： l1.正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组 组长菌。 l2.所有的皿都不长菌：转化系统有问题。 l3.都长菌：试剂或操作过程中被污染。 l4.连接不成功。 药基基因工程59 PCR 。 PCR(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，聚合酶链反应， 其原理是其原理是依据细胞中DNA半保留复制机理，DNA在不同温 度下变性、复性的特性，人为控制温度高温变性、低 温复性、适温延伸，循环多次后，可使目的基因得到扩增。 以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别于模板5末 端和3末端互补配对的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合 酶的作用下，按照半保留复制的

44、机制沿着模板链延伸至完 成新的DNA合成，重复这一过程（变性、退火、延伸）， 即可使目的DNA片段得到扩增。 药基基因工程60 5 引物引物A 5 引物引物B 第二次循环第二次循环 第一次循环第一次循环 5 5 5 5 5 5 模板模板DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理 药基基因工程61 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量 可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。 第三次循环第三次循环 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 药基基因工程62 lPCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分：模板DNA（ng，无

45、严 格要求）；特异性引物（通常0.1-0.5umol/L）； DNA聚合酶（2.5-5U）；dNTP(20-200umol/L)； 含Mg2+的缓冲液（Mg2+1.5mmol/L,Tris-HCl pH8.3-8.8,KCl50mmol/L,明胶0.1%,甲酰胺5%） lPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤：变性，退火、延伸，可循 环25-30次，扩增效率为P=A*(1+X)n 药基基因工程63 三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤 变性变性 95C 延伸延伸 72C 退火退火 Tm-5C 药基基因工程64 l主要用途：主要用途：目的基因克隆；基因的体外突变；DNA的微量分析 lPCR的

46、特点：的特点：高度的敏感性；高度的特异性；操作简便，快速；广泛 的适用性 lPCR在医学中的应用：在医学中的应用：遗传性疾病的基因诊断；病原体的检测；癌基 因与抑癌基因的检测；在法医学上的应用。 lPCR引物设计原则：引物设计原则：引物长度15-30bp；GC含量40%-55%；Tm高于 550C；引物与模板非特异性配对的配对率70%;引物之间配对的碱 基数3；引物自身配对15kb)(15kb)转移不转移不 完全完全, ,转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。 先经弱酸作用引起部分脱嘌呤作用，然后用强碱处理水解先经弱酸作用引起部分脱嘌呤

47、作用，然后用强碱处理水解 脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的DNADNA片段可高效率转移片段可高效率转移, , 双链变成单链双链变成单链. . lSouthernSouthern转移：毛细管转移转移：毛细管转移( (转移的速率取决于转移的速率取决于DNADNA片断的片断的 大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。 l制备探针：制备探针：DNADNA的切口平移（利用的切口平移（利用DNADNA聚合酶具有聚合酶具有3355 聚合活性和聚合活性和5533外切酶活性进行标记）；随机引物合外切酶活性进行标记）；随机引物合 成成 l预杂交，杂交及杂交信号检测预杂交，杂交及杂交信号检测 药基基因工程80 Dot blot (斑点杂交）斑点杂交） lDNA转移固化转移固化 l探针标记探针标记 l杂交杂交 l免疫检测免疫检测 药基基因工程81 l一、一、DNA转移固化转移固化 待检测待检测DNA的分离纯化的分离纯化 DNA变性：变性：1000C 10min快速置冰浴（作系快速置冰浴（作系 列稀释：列稀释：total 10ul, 2ug, 0.2ug, 20ng, 2ng, 0.2ng, 20pg, 2pg） 变性后的变性后的DNA点到点到NC膜上（膜上（NC膜先在膜先在 10SSC中浸泡中浸