CLU的基因多态性与非痴呆型血管认知障碍相关性的研究论文设计

1、CLU的基因多态性与非痴呆型血管认知障碍相关性的研究 摘要：目的:探讨CLU基因多态性与VCIND患者之间的相关性。 方法:收集VCIND研究组患者44例,认知正常对照组23例，记录人口学资料、危险因素、现病史、既往史，进行神经系统查体、神经心理学量表评分及核磁共振检查。检测和分析两组CLU基因rs11136000snp、rs93311888snp位点，比较CLU基因多态性与VCIND患者及其影像学之间的相关性。 结果:(1)VCIND组与认知正常组的rs11136000snp位点对比，P0.05，差异有统计学意义。rs9331888snp位点的P0.05，无显著性差异。（2）VCIND组与对

2、照组SVD总分对比，P0.05，存在显著性。（3）CLU基因多态性与VCIND患者的影像学比较，P0.05，存在显著性。 结论：CLU基因多态性与VCIND具有相关性；CLU基因的两个snp位点均与VCIND患者的影像学存在交互作用。关键词：CLU基因多态性；非痴呆型血管认知障碍；磁共振成像；交互作用 Study on the correlation between gene polymorphism of CLU and non-dementia vascular cognitive impairmentJiang Zi-he,Mudanjiang Medical University,Mu

3、danjiang city, heilongjiang province,157000Yin Chang-hao,Mudanjiang Medical University,Mudanjiang city, heilongjiang province,157000Zhu Xiao-feng,Mudanjiang Medical University Hongqi Hospital,Mudanjiang city, heilongjiang province,157000Objective: to investigate the correlation between CLU gene poly

4、morphism and VCIND. Methods: 44 patients in VCIND study group and 23 patients in cognitive control group were collected. Demographic data, risk factors, history of present illness and previous history were recorded. The rs11136000snp and rs93311888snp of two groups of CLU genes were detected and ana

5、lyzed, and the correlation between CLU gene polymorphism and VCIND patients and their imaging was compared. Results :(1) the rs11136000snp of the VCIND group and the cognitively normal group were compared, and the difference was statistically significant (P 0.05. (2) the comparison of total SVD scor

6、es between VCIND group and control group showed that P 0.05 was significant. (3) imaging comparison between CLU gene polymorphism and VCIND patients showed that P 0.05 was significant. Conclusion: CLU gene polymorphism is correlated with VCIND. The two SNP loci of CLU gene interacted with the imagin

7、g of patients with VCIND.Key words: CLU gene polymorphism; Non-dementia vascular cognitive impairment; Magnetic resonance imaging; Interaction血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是脑血管病变及其危险因素导致的临床卒中或亚临床血管性脑损伤，涉及至少一个认知域受损的临床综合征，涵盖了从轻度认知障碍到痴呆，也包括合并阿尔茨海默病(AlzheimerS disease，AD) 等混合性病理所致的不同程度的认知障碍。

8、根据流行病学研究1，我国65岁以上的人群中VCI患病率约为8.7%。非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment-no dementia with small vessel disease，VCIND)为血管性痴呆的早期阶段，具有很高的危险性转化为痴呆。对VCIND患者随访2年发现其演变为痴呆的比例高达40%2。VCIND患者3年内转化为VaD的概率为35%3；研究4同样显示50%的VCIND患者有可能转化为痴呆。VCIND临床上主要表现以注意力、执行功能的减退，以及运动操作和信息处理速度的减慢为主，其可能与额叶-皮质下环路的阻断有关。VCI越来越成为一个

9、严重的社会问题。CLU基因编码clusterin，也称为载脂蛋白J，是中枢神经系统中表达最丰富的载脂蛋白之一，可影响A聚集、介导A清除、调节脂质代谢、诱发补体反应以及神经炎症反应。CLU作为高密度脂蛋白的组成部分，参与胆固醇的转运，可能与动脉粥样硬化等疾病5等有关。我们推测CLU基因可能与血管性认知障碍有关，目前有关此的方面研究较少，本研究采用病例对照方法探讨CLU基因rs11136000snp位点及rs9331888snp位点多态性与VCIND的相关性。1. 研究方案1.1受试者收集本研究采用神经心理学量表临床评估的方法在牡丹江医学院红旗医院招募右利手VCIND 42人，认知正常对照组23人

10、。入组标准（参照“2016中国血管性认知障碍诊疗指导规范”中VCIND的诊断标准6）：（1）存在记忆力减退或主观认知障碍的主诉，持续3个月以上；（2）既往有脑血管疾病；（3）认知评估：采用MMSE、MoCA神经心理学评估量表；（4）无痴呆表现，临床痴呆评定量表（clinical dementiarating,CDR）0.5。排除标准：其他可引起认知功能障碍的疾病，例如可引起认知功能障碍的神经系统其他疾病（如脑肿瘤、帕金森病、脑炎、癫痫等）、脑外伤导致的MCI；其他可引起认知损害的疾病，如甲状腺功能异常、严重贫血、梅毒、HIV、药物、酒精等；有精神病史者或先天精神发育迟缓者；排除有严重听、视力障

11、碍，不能配合完成检查者。1.2 神经心理学评估：MMSE中文版采用张明园修订版，MoCA中文版采用北京版：MoCA评分13分(文盲），19分(小学），24分(初中及以上）；MMSE评分19分(文盲），22分(小学），26分(初中及以上），CDR各项均0.5分。1.3 影像学评估：使用荷兰飞利浦公司3.0T TX磁共振仪进行影像学检查。所有受试者均接受T1、T2、弥散加权成像、液体衰减反转恢复序列以及磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI)，以识别各种标志性影像学改变。采用总SVD评分项目7包括：腔隙性数量1个，CMBs数量1个，EPVS,WMH脑

12、室周围 Fazekas评分3分或深部，上述项目各计1分，各项相加为总SVD评分。(采集患者头部磁共振成像例图如下图A、B、C、D) A.腔隙性脑梗死 B.脑微出血 C.血管周围间隙 D.脑白质高信号1.4 DNA提取方法及检测 DNA提取收集空腹静脉血5ml并置于-80冰箱中，分批进行DNA 的提取，质控合格。研究中SNP基因库信息来自公共数据库NCBI GeneBank 数据库，查询基因CLU标准序列。其序列号为 rs11136000 及 rs9331888位点。采用Primer Premier 3.0软件设计 SNPrs11136000 及 rs9331888 位点的 KASP 引物rsl

13、1136000snp位点Primer Allele FAM 引物序列为5-CCCTGAATCTTACCTTTCTATTGC-3, Primer Allele HEX 引物序列为 5-AAACTCCTGACCCCAAGTAATATG-3，rs9331888snp位点 Primer_Allele FAM 引物序列为5-CAATTCCCTTCGGAGAGTAGAG-3, Primer_Allele HEX 引物序列为 5-GAAAGGGTCCATTGTGTAAGAC-3。通过翼和应用生物技术有限公司得出PCR产物，样本纯化后高通量测序，测序得到的原始二进制basecalling数据经Illumina

14、 bcl2fastq软件转化为序列数据，Illumina RTA软件进行图像识别和Basecalling，Illumina bcl2fastq 2.17根据每个样本的index信息进行demultiplexing并统计产出reads数和碱基测序质量（Q30）。rs11136000snp位点散点图 rs9331888snp位点散点图1.5统计分析：使用社会科学统计软件包（SPSS，21.0）进行统计分析。使用卡方检验、独立样本T检验评估人口统计学变量的分类。进行 HardyWeinberg 平衡定律吻合度测定，采用卡方检验、随机区组设计资料的多因素方差分析进行比较。所有的统计检验都是双侧概率检验

15、，检验水准以P0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1. 人口学资料及血管性危险因素的比较VCIND组和认知正常组在年龄、性别、民族方面无统计学差异，具有可比性；两组在吸烟、饮酒史、糖尿病、心脏病、高脂血症等方面无差异，在高血压方面有统计学差异(P 0.05)，高同型半胱氨酸(P =0.071，0.1)，其存在较弱显著性(见表1)。表1 人口学资料及血管性危险因素分析组别项目认知正常（23例）VCIND（44例 ）t或卡方值p值性别（男/女）11/1226/161.2010.273年龄61.9110.1064.368.13-1.063 0.292 民族（朝鲜/民族/蒙古）2/21/03/38

16、/10.5950.743糖尿病 (无/有)19/432/100.3620.547高血压(无/有)14/914/284.5960.032心脏病(无/有)19/437/50.3750.54吸烟(无/有)15/827/150.0060.94饮酒(无/有)16/728/140.0570.811空腹血糖（mmolL）6.062.316.373.46-0.393 0.696 总胆固醇（mmolL）4.331.004.570.92-0.9470.347甘油三酯（mmolL）1.620.931.570.890.1940.846高密度脂蛋白（mmolL)1.290.321.310.29-0.289 0.774

17、低密度脂蛋白（mmolL）2.360.862.550.780.911 0.366 同型半胱氨酸（umolL）14.469.5820.1815.17-1.8410.0712.2.基因型和等位基因频率分布 CLU基因认识rs11136000snp位点共3种基因型:TT型、TC型、CC型(见图2 )。 两组TT基因型和T等位基因频率分布相比,VCIND组(23.8%、36.9%)明显高于对照组(4.3%、10.9%),差异有统计学意义。且CLU基因rs11136000位点基因携带者（CCCT）罹患VCIND的风险是非基因携带者（TT）的6.875倍（95CI为0.820-57.626，P0.05）。

18、Rs9331888snp位点共3种基因型:GG型、GC型、CC型(见表3),两组基因型与等位基因对比，P0.05，无显著性差异。表2 Rs11136000与VCIND的关系分组例数基因型等位基因TTTCCCTC认知正常231(4.3%)3(13.0%)19(82.6%)5（10.9%）4（89.1%）VCIND4210(23.8%)11(26.2%)21(50.0%)31（36.9%）53（63.1%）X2值 7.087 10.062P值 0.029 0.002表3 Rs9331888与VCIND的关系分组例数基因型等位基因CCCGGGCG认知正常234(17.4%)9(39.1%)10(43

19、.5%)17（37.0%）29（63.0%）VCIND429(21.4%)21(50.0%)12(28.6%)39（46.4%）45（53.6%）X2值 1.477 1.088P值 0.478 0.2972.3.VCIND与SVD评分的相关性 VCIND组与认知正常组相比,有显著差异(P 0. 001)。在SVD总分（2、3、4分）上，认知障碍组（50.0%、23.8%、4.8%）均大于认知正常（21.7%、4.3%、0.0%）（表4），提示在VCIND患者中，多有腔隙性脑梗死、颅内微出血、血管间隙、脑白质改变等颅内结构性变化。表4 VCIND与影像学评分之间的关系SVD总分01234分组认知

20、正常236(26.1%)11(47.8%)5(21.7%)1(4.3%)0(0.0%)VCIND420(0.0%)9(21.4%)21(50.0%)10(23.8%)2(4.8%)X2值 21.711P值0.001在SVD评分亚组中，腔隙性脑梗死、血管间隙、脑白质改变中P值均0.05，有显著性差异（表5），故提示有腔隙性脑梗死、血管间隙、脑白质改变的患者更容易产生认知障碍。表5 VCIND与影像学评分之间的关系分组例数影像学分型腔隙性CMBsEPVSWMH认知正常2316(69.6%)1(4.3%)4(17.4%)3(13.0%)VCIND4238(90.5%)9(21.4%)18(42.9%

21、)21(50.0%)X2值4.6223.3314.3048.715P值0.0320.0680.0380.0032.4.CLU基因snp位点与VCIND影像学交互作用 rs11136000snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F12.869，P0.05，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因rs11136000位点与VCIND影像学存在交互作用（表6）。rs9331888snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F11.288，P0.05，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因 rs9331888位点与VCIND影像学存在交互作用（表7）。表6 rs11136000snp位点VCIND患者与影像

22、学的交互作用分组Rs11136000例数总SVD评分VCINDCC211.810.784TC111.640.929TT102.900.738认知正常组CC191.210.787TC30.330.577TT10.00F值 12.869P值 0.001表7 rs9331888snp位点VCIND患者与影像学的交互作用分组Rs9331888例数总SVD评分VCINDCC92.000.707CG211.950.740GG122.500.905认知正常组CC40.500.577CG91.001.118GG101.300.483F值 11.288P值 0.0013.讨论根据AlzGene数据库，CLU是认

23、知障碍中第三重要的诱发基因，是单拷贝基因，位于8p21号染色体上，包含9个外显子、8个内含子，含有16580个碱基，编码449个氨基酸组成的多肽链。CLU mRNA表达具有组织特异性，在大脑内膜重构和细胞可塑性方面起到重要的作用。CLU编码的糖蛋白在淀粉样蛋白斑中沉积，结合可溶性A肽，与A相互作用影响其构象和毒性，也参与血脑屏障A的清除8。相关研究9提示CLU聚集素不仅存在于斑块，而且还存在于小动脉和毛细血管。A可能通过降低脑灌注、减少血管储备和增加缺血性损伤而导致血管调节失调。Hee小组10研究表明：大约30%的皮质下血管认知障碍在正电子发射断层扫描上有显著的A负荷。Huang等人11的研究

24、招募了5名因一侧颈动脉狭窄而患有脑低灌注的痴呆症患者，他们接受了18F-AV1451PET的检查，结果显示痴呆症和单侧颈动脉狭窄的患者与正常对照组相比，整体淀粉样蛋白沉积明显增加。Ye等人12的研究使用了纵向的队列设计，结果表明淀粉样蛋白负荷独立地导致了小血管疾病患者的认知能力下降。综上，CLU基因多态性的表达可使A增加，从而造成大脑功能障碍和损害。故CLU基因的多态性可能与血管性认知障碍的发病有关。本研究得出的数据如预期的证实了这一观点，发现在VCIND组与认知正常组的比较中，CLU基因的rs11136000snp位点携带者更容易出现认知障碍，但本实验中CLU基因的rs9331888snp位

25、点与认知障碍无明显相关性。另一方面，CLU基因多态性可能通过血脂代谢途径影响血管性认知障碍。血管内膜脂质集聚，脑血管内皮功能减弱,损害大脑的新陈代谢,继而出现认知功能障碍。Anna Rull团队的研究13发现在致密高密度脂蛋白颗粒的子集中存在CLU表达的蛋白，它可以抑制脂质过氧化或降解低密度脂蛋白氧化。CLU基因多态性可通过加剧脂质沉积造成血管性认知功能障碍。我们还发现VCIND与核磁共振上腔隙性脑梗死、脑微出血、脑白质高信号、血管周围间隙密切相关。既往研究表明小血管疾病是血管性认知障碍中最常见的损害；小血管疾病以动脉硬化和腔隙性梗死为主要特征，可引起皮质和皮质下微梗死，并对白质造成弥漫性缺血

26、性损害14。Hanna Jokinen等人15在3年的随访中发现：在MRI测量的多变量模型中，总的WMH、腔隙仍然是认知功能的独立预测因子。本研究结果与既往研究结果一致。CLU基因多态性与VCIND相关的影像学存在交互作用P0.01，具有较强的相关性，因此携带CLU基因rs11136000位点、rs9331888位点的VCIND患者颅内更易出现腔隙性脑梗死、脑白质疏松、血管间隙等影像学变化，导致认知障碍。但上述结果仍需扩大样本量进一步证实。本研究的不足：更大的样本量可能更有助于检测基因多态性对血管性认知障碍的影响。另外，CLU基因最初被认为与AD有关的认知障碍密切相关，对于其与血管性认知障碍的

27、研究较少，可加强纵向随访、增加相关研究。4.小结VCIND是一个相对较新的概念，关注相关的基因表达可能会缩小真正的高危人群，降低并延缓血管性痴呆的发病率。本研究发现CLU基因的rs11136000snp位点与认知障碍密切相关。若能进一步证实CLU基因与血管认知障碍的相关机制，将有助于早期预防、早期干预痴呆的疾病，具有重要的临床价值。参考文献1YueHana,AihongZhoua,FangyuLiab,etal,Apolipoprotein E 4 allele is associated with vascular cognitive impairment no dementia in Ch

28、inese populationJ,J. Neurol. Sci.2020 Feb 15;4092冯学敏，刘晓冰，张仁生等，血清脑源性神经营养因子水平与血管性痴呆的相关性研究J，中风与神经疾病杂志，2013（9）：821-823.3Zanetti M,Ballabio C,Abbate C,et al.Mild cognitive impairment subtypes and vascular dementia in community-dwelling eldly people:a 3-year follow-up studyJ.J Am Geriatr Soc.2006.54(4):58

29、0-6.4Jia J,Wei C,Liang J,et al.The effects of DL-3-n-butyphthalide in patients with vascular cognitive impairment without dementia caused by subcortical ischemic small vessel disease:A multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled trialJ. Alzheimera Dement 2016.12(2):89-99.5 Park S, Math

30、is K, Lee I (2014) The physiological roles of apolipoprotein J/clusterin in metabolic and cardiovascular diseases.Rev Endocr Metab Disord 15(1):4553.6国家卫生计生委脑卒中防治工程委员会，脑卒中防治系列指导规范编审委员会. 2016中国血管性认知障碍诊疗指导规范J. 心脑血管病防治，2017，17（1）: 3-6.7顾雨铖，刘任远，秦若梦等，总MRI脑小血管病评分与认知功能的相关性J，国际脑血管病杂志，2018年7月第26卷第7期。8 Bell R

31、D，Sagare AP，Friedman AE，et a1Transport pathways for clearance of human AlzheimerS amyloid betapeptide and ap01 ipoproteins E and J in the mouse central nervous systemJCerebBlood Flow Metab，2007，27：9099189 J. Scott Miners; Polly Clarke; Seth Love,Clusterin levels are increased in Alzheimers disease and influence the regional distribution of AJ,Brain Pathol.2017 05;27(3)10Hee Jin Kim, Seongbeom Park, Hanna Cho, et al.Assessment of Extent and Role of Tau in Subcortical Vascular Cognitive Impairment Using18F-AV1451 Positron Emission Tomog