酶免测定技术课件

1、酶免测定技术1 酶免疫测定技术 广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇 酶免测定技术2 概述 1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量 检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等） 进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后， 不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中 的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术 2 标记免疫技术的分类： 按标记物分类：同位素标记 荧光素 酶标记 等等 按检测对象分类：免疫组织化学技术 免疫测定技术 酶免测定技术3 酶免疫测定技术 概述： 1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂 抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗 体或抗原反应后，测定复合物中的

2、酶，这种 免疫技术，称为酶标记免疫技术。 2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法 异相法 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直 接测定的方法。异相法 则需分离后测定 酶免测定技术4 均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术): 2.克隆酶供体免疫测定 ： 位阻 ED ED EA EAED Ab Ab 活性酶 标本中Ag 酶免测定技术5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 第一节ELISA的原理和类型 一、基本要求： 1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持 免疫活性。 免疫吸附剂 2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性， 又

3、有酶的活性。 酶结合物 3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表 面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有 色反应。 底物 酶免测定技术6 二、必备试剂： 固相的Ag或Ab-免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag-结合物 酶反应的底物-底物 三、方法类型： 夹心法 间接法 竞争法 捕获法测IgM抗体 酶免测定技术7 标本 标本 酶标 抗体 底物 显色 有色为阳性 显色 有色为阳性酶标 二抗 底物 酶免测定技术8 3.竞争法 Ag AgAb + Ab Ag(标本) (定量) AgAb E E 终止液 标本酶标抗体 底物 显色 显色 固相 固相 标本 酶标二抗 底物 1.夹心法 2.间接法 酶

4、免测定技术9 第二节 ELISA的技术要点 一、试剂制备 免疫吸附剂 酶标记抗原或抗体 二、反应条件的选择 酶标二抗浓度选择 包被抗原浓度的选择 三、操作标准化 酶免测定技术10 一、试剂制备： 免疫吸附剂 固相载体 要求： 吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 载体性能比较 载体材料：+、- 结果差别大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV10%。 酶免测定技术11 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包

5、被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液、包被方法 封闭：包被后在用15%小牛血清白蛋白再包 被，以消除非特异吸附的干扰。 酶免测定技术12 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2. ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm) 四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黄色) -萘酚(红色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(红色) 4-氯-1

6、-萘酚(灰蓝色) 酶免测定技术13 AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 -半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光 4. 酶结合物的制备： 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法 酶免测定技术14 二、反应条件的选择 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标 二抗，取OD=0.8者。 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 温度、时间等 三、操作标准化 1 加样 2 保温 3 洗涤 4 比色 酶免测定技术15 四、影响ELISA

7、测定的因素： 试剂盒因素 1实验操作中的影响 酶免测定技术16 试剂盒因素： A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成 (多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光) TMB：水溶性差(商品：配好) E 运输储存 酶免测定技术17 操作中的注意事项： 1 标本的收集和保存 试剂的准备 加样 温育 洗板 显色 比色 2结果判断 酶免测定技术18 样品的收集和保存： 1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)。 2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-” (破坏Ag或A

8、b)或假“+”(非特异蛋白) 。 3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。 4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本 底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。 酶免测定技术19 试剂的准备： 注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。 酶免测定技术20 加样： 总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白 酶免测定技术21 温育： 4过夜最佳， 372h较好， 4320min可造成弱“+”假“-” 2 水浴较温箱等空气浴均匀 酶免测定技术22 洗板： 手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量。 酶免测定技术23 显色 对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%, 易造成弱“+”假“-” 酶免测定技术24 比色： 单波长比色需设空白孔： OD=OD样品-OD空白 双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm 酶免测定技术25 结果判断： 1 注意夹心法假“-” 2 用cut-off(CO)值判断 3 “灰区”时建议动态观察 4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg 酶免测定技术26 五. ELISA出现“一片黄”的原因： 酶结合物浓度过高 底物不新鲜