酶与细胞固定化课件

1、游离酶的缺点：游离酶的缺点： (1) 酶的催化效率不够高酶的催化效率不够高 (2) 酶的稳定性较差酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有（热、酸碱、有机溶剂对其有 影响）。影响）。 (4)产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难 ，酶在催化反应结束后，酶在催化反应结束后 与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一 定的困难。定的困难。 (3)酶使用后通常不能回收，这种酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶一次性使用酶的的 方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产，方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产， 从而导致酶的使用效率低，产品成本

2、高。从而导致酶的使用效率低，产品成本高。 借助各种借助各种物理或化学方法物理或化学方法，将，将 酶固定于酶固定于水不溶性载体水不溶性载体上的过程。上的过程。 固定在载固定在载 体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 水不溶性酶水不溶性酶 水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体 水不溶性酶水不溶性酶 （固定化酶）（固定化酶） 固定化技术固定化技术 可以反复使用，有利于工艺的连续化。可以反复使用，有利于工艺的连续化。 反应后易于分离，简化了提纯工艺，反应后易于分离，简化了提纯工艺， 产物得率高，利于提高产品质量。产物得率高，利于提高产品质量。 可提高稳定

3、性可提高稳定性 反应过程可以严格控制，有利于工艺反应过程可以严格控制，有利于工艺 自动化。自动化。 适应于多酶反应体系。适应于多酶反应体系。 一、固定化酶的优缺点一、固定化酶的优缺点 缺缺 点点 比较适应水溶性底物和小比较适应水溶性底物和小 分子底物。分子底物。 固定化成本高。固定化成本高。 酶固定化时酶的活力酶固定化时酶的活力 有所损失。有所损失。 1.吸附法吸附法 2.包埋法包埋法 3.共价偶联法共价偶联法 4.交联法交联法 固定化方法固定化方法 吸附法吸附法结合法结合法交联法交联法包埋法包埋法 网格型网格型微囊型微囊型 离子键离子键 结合法结合法 物理物理 吸附法吸附法 共价键共价键 结

4、合法结合法 （1 1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或）定义：利用各种固体吸附剂将酶或 含酶菌体吸附在其表面上。含酶菌体吸附在其表面上。 物理吸附法（物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion） 作用力：氢键、疏水键作用力：氢键、疏水键 常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成纤维素、大孔合成 树脂树脂等。等。 优点：优点： 缺点：缺点： （3 3）制备方法：）制备方法： a. a. 静态法静态法 (statia procedure) (statia

5、procedure) ： 没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液，没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液， 通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。 b.b.电沉积法电沉积法 (electrodeposition procedure) (electrodeposition procedure) ： 在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体， 接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定

6、接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定 化酶。化酶。 该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注 意酶在电场中的稳定性。意酶在电场中的稳定性。 c. c. 混和振摇装载法混和振摇装载法 (mixing or shaking bath (mixing or shaking bath loading) loading) ： 是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅 拌下或摇床连续振摇下完成固定化。拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，该法固定化较为均匀，要注意搅

7、拌或振摇速率， 既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。 d. d. 反应器装载法反应器装载法(reactor loading process)(reactor loading process)： 这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用 连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液， 然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。 (1) (1) 定义：定义：将酶分子包埋在各种多孔载体中，将酶分子包埋在各种多孔

8、载体中， 制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶 性性小分子底物小分子底物转化反应。转化反应。 2 2、包埋法：、包埋法：(entrapment)(entrapment) (2)(2)包埋法的类型：包埋法的类型：酶被包埋成网格型称为酶被包埋成网格型称为凝凝 胶胶包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊微胶囊包埋包埋 法。法。 包埋过程包埋过程不发生反应不发生反应 凝胶包埋法（网格型）：凝胶包埋法（网格型）： 将酶包埋在凝胶内部的微将酶包埋在凝胶内部的微 孔中。孔中。 微胶囊包埋法（微囊型）：微胶囊包埋法（微囊型）： 将酶包

9、埋在高分子半透膜将酶包埋在高分子半透膜 中。中。 a. a. 凝胶包埋：凝胶包埋： 使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点 海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至滴至 海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法： 滴至滴至 角叉菜胶角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法： 过硫酸钾过硫酸钾 Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) 二甲氨基丙腈二甲氨基丙腈 b. b. 微囊型包埋微囊型包埋(micr

10、oencapsulation)(microencapsulation)： 又称半透膜包埋法：又称半透膜包埋法： 将酶包埋于由各种将酶包埋于由各种高分子高分子聚合物（直径几十微聚合物（直径几十微 米几百微米，厚约米几百微米，厚约25mm25mm的半透膜）制成的小球内，的半透膜）制成的小球内， 制成固定化酶。制成固定化酶。 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性 剂乳化液包埋法。剂乳化液包埋法。 分述如下：分述如下： 界面沉降法：界面沉降法： 利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度利用高

11、聚物在水相和有机相的界面上溶解度 降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例：例： 以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先 将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳 化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤 维素在酶液液滴周围凝聚，最后用维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20Tween20破乳破乳 化后，就可得到含酶的火棉胶囊。化后，就可得到含酶的火棉胶囊。 脂质体包埋：脂质体包埋： 将酶包埋于脂质体将酶包埋于脂质体(Liposome

12、)(Liposome)中的方法。脂质中的方法。脂质 体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 脂质体包埋的特点：脂质体包埋的特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物 携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因 此，其在药物应用方面受到重视此，其在药物应用方面受到重视。 与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1 1）固定化酶颗粒小。）固定化酶颗粒小。 2 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注）半透膜能阻止蛋白质分

13、子渗漏和进入，注 入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使 酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学 价值。价值。 缺点：缺点：反应条件要求高反应条件要求高, ,制备成本也较高。制备成本也较高。 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法，与其它固定化方法相比：法，与其它固定化方法相比： 优点：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变 酶的高级结构，酶活回收率高。酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。只适合作用于小分子

14、底物和产物的酶。 1 1）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding） 作用力：离子键作用力：离子键 常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、 DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素 3.3.结合法结合法 载体通过载体通过共价键共价键或或离子键离子键与酶结合的固定与酶结合的固定 化方法。化方法。 1 1）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding） 作用力：离子键作用力：离子键 常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、 DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤

15、维素纤维素 优缺点：优缺点： 催化效率损失小；催化效率损失小； 结合力弱，改变结合力弱，改变pHpH和离子强度和离子强度 可使酶脱落。可使酶脱落。 借助共价借助共价 键将酶的活性键将酶的活性 非必需侧链基非必需侧链基 团团和载体的功和载体的功 能基团进行偶能基团进行偶 联。联。 2 2）共价结合法）共价结合法 A. A. 载体：亲水载体优于疏水载体载体：亲水载体优于疏水载体 如如: :天然高分子衍生物天然高分子衍生物: : 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但

16、有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙 亲水性好，亲水性好， 有一定机械强度有一定机械强度 2 2）偶联方法：）偶联方法： 芳香氨基芳香氨基 羟基羟基 羟甲基羟甲基 氨基氨基 载载 体体 上上 的的 功功 能能 基基 团团 酶酶 分分 子子 上上 的的 非非 必必 需需 侧侧 链链 基基 团团 游离氨基游离氨基 胍基胍基 酚羟基酚羟基 巯基巯基 咪唑基咪唑基 羟基羟基 重氮法重氮法 叠氮法叠氮法 卤化氢法卤化氢法 烷化法烷化法 缩合法缩合法 常常 用用 的的 偶偶 联联 反反 应应 例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应 ROCH2C6H4NH2+HNO

17、2 ROCH2C6H4N+N+H2O 载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基酚基或咪唑基发生偶联反应发生偶联反应 值得固定化酶。值得固定化酶。 ROCH2C6H4N+=N+E ROCH2C6H4N NE 亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成： NaNO2+HCl HNO2+NaCl 叠氮法：叠氮法： 含有含有酰肼基团酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮 化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲 酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的

18、酰肼衍生物，酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物， 然后再与亚硝酸反应得到然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物叠氮化合物，这种产物能在，这种产物能在 低温、低温、pH 7.5pH 7.58.58.5的情况下和酶的的情况下和酶的氨基氨基直接偶联。直接偶联。 叠氮衍生物也能和叠氮衍生物也能和羟基羟基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基反应。反应。 ROCH2COOH+CH3OH ROCH2COOCH2 +H2O CMC CMC甲酯甲酯 R-O-CH2-COO-CH2 +NH2-NH2 R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OH CMC甲酯甲酯 肼肼 CMC酰肼衍生物酰肼衍生物 ROCH2CONHNH

19、2+HNO2 ROCH2CON3+2H2O ROCH2CON3 +H2NE ROCH2CONHE ROCH2CON3 +HOE ROCH2COOE ROCH2CON3 +SHE ROCH2COSE 烷基化法：烷基化法： 含含羟基羟基的载体也可在的载体也可在碱性碱性条件下和条件下和均三氯均三氯 三嗪三嗪(triazinyl)(triazinyl)等反应，在引入活泼的卤素等反应，在引入活泼的卤素 后能直接与酶的后能直接与酶的氨基氨基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基等偶联。等偶联。 优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻酶与载体结合牢固，不会轻 易脱落，可连续使用。易脱落，可连续使用。 缺点：缺点：反应条件

20、较激烈，易影响酶反应条件较激烈，易影响酶 的空间构象而影响酶的催化活性。的空间构象而影响酶的催化活性。 4.4.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子 与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形 成共价键连接来制备固定化酶的方法。成共价键连接来制备固定化酶的方法。 双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 戊二醛有两戊二醛有两 个醛基，均可与个醛基，均可与 酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游 离氨基反应离氨基反应, ,使酶使酶 蛋白交联。蛋白交联。 此法与共

21、价偶联法利用的均是共价键。此法与共价偶联法利用的均是共价键。 在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联 形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳， 为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上， 或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定 化酶化酶“网网”膜或膜或“网网”颗粒。这种方法又称为颗粒。这种方法又称为双双 重固定化法。重固定化法。 交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生 在分子内。在分子内。 酶

22、浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解状态（修饰）。持溶解状态（修饰）。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态（固定化）。不溶态（固定化）。 缺点：缺点： (1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。 (2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。带来不便。 优点：优点： 制备简单、结合牢固、可以长时间使用。制备简单、结合牢固、可以长时间使用。 固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子

23、结离子结 合法合法 共价结共价结 合法合法 交联交联 法法 制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难 结合程度结合程度弱弱强强中等中等强强强强 活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等 再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能 费用费用低低低低低低高高中等中等 底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变 各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较 固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子结离子结 合法合法 共价结共价结 合法合法 交联交联 法法 制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难 结合程度结合程度弱弱强强中等

24、中等强强强强 活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等 再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能 费用费用低低低低低低高高中等中等 底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变 各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较 三、固定化酶的性质三、固定化酶的性质 大多数酶固定化后，酶活性下降。大多数酶固定化后，酶活性下降。 原因：（原因：（1 1）构象改变；（）构象改变；（2 2）空间位阻）空间位阻 （3 3）活性中心与载体结合）活性中心与载体结合 相对活力低于相对活力低于75%75%， 没有实际应用价值。没有实际应用价值。 (4)对变性剂的耐

25、受性提高，在尿素、有机溶对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶 剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保 留较高的酶活力等。留较高的酶活力等。 (1)对热的稳定性提高，可以耐受对热的稳定性提高，可以耐受 较高的温度。对酸碱耐受力增强。较高的温度。对酸碱耐受力增强。 (2)固定化后半衰期增长，保存稳固定化后半衰期增长，保存稳 定性好。定性好。 (3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易对蛋白酶的抵抗性增强，不易 被蛋白酶水解。被蛋白酶水解。 影响原因：影响原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度，固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 并且固定化后酶分子与载体并且固定化后

26、酶分子与载体多点连接多点连接，可防止，可防止 酶分子伸展变形。酶分子伸展变形。 抑制酶自身降解，酶与载体固定化后抑制酶自身降解，酶与载体固定化后失去了失去了 分子间相互作用的机会分子间相互作用的机会，从而抑制了其自身的，从而抑制了其自身的 降解过程。降解过程。 固定化部分阻挡了固定化部分阻挡了外界不利因素外界不利因素对酶的侵袭，对酶的侵袭， 但是如果固定化触及到酶的活性部位或调节部但是如果固定化触及到酶的活性部位或调节部 位，也可能导致酶稳定性下降。位，也可能导致酶稳定性下降。 带带负电负电荷载体荷载体 ：最适：最适pH pH 向向碱性碱性偏移。偏移。 带带正电正电荷载体荷载体 ：最适：最适p

27、H pH 向向酸性酸性偏移。偏移。 不带电不带电荷载体荷载体 : : 最适最适pHpH一般一般不改变不改变。 (2) (2) 产物性质对最适产物性质对最适pHpH影响；影响； 酶催化反应产物为酶催化反应产物为酸性酸性：最适：最适pHpH向向碱性碱性偏移。偏移。 酶催化反应产物为酶催化反应产物为碱性碱性：最适：最适pH pH 向向酸性酸性偏移。偏移。 酶催化反应产物为酶催化反应产物为中性中性：最适：最适pHpH不改变不改变。 影响原因：影响原因： 固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液 体包围着，这层不流动液体叫做扩散层。载体的带体包围着，这层不

28、流动液体叫做扩散层。载体的带 电性质之所以会影响固定化酶的最适电性质之所以会影响固定化酶的最适pHpH值，是由于值，是由于 在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的 氢离子氢离子(H+)(H+)到其附近，致使固定化酶所处反应区域到其附近，致使固定化酶所处反应区域 的的pHpH值比周围反应液的值比周围反应液的pHpH值低一些，这样就必须把值低一些，这样就必须把 反应液的反应液的pHpH值提高一些，才能使酶充分发挥其催化值提高一些，才能使酶充分发挥其催化 功能。故此，固定化酶的最适功能。故此，固定化酶的最适pHpH显得比游离酶的最显得比游离酶的最 适

29、适pHpH值高一些。反之，带正电荷的载体对氢氧根负值高一些。反之，带正电荷的载体对氢氧根负 离子有吸引作用，由它制备的固定化酶的最适离子有吸引作用，由它制备的固定化酶的最适pHpH值值 要比游离酶的最适要比游离酶的最适pHpH值低一些。值低一些。 影响原因：影响原因： 固定化载体成为扩散阻碍，使反应产物向外扩散受固定化载体成为扩散阻碍，使反应产物向外扩散受 到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由 于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域 内，使此区域内的内，使此区域内的pHpH值降低，必需提高周围

30、反应液值降低，必需提高周围反应液 的的pHpH值，才能达到酶所要求的值，才能达到酶所要求的pHpH值。为此，固定化值。为此，固定化 酶的最适酶的最适pHpH值比游离酶要高一些。反之，反应产物值比游离酶要高一些。反之，反应产物 为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pHpH 值升高，故此使固定化酶的最适值升高，故此使固定化酶的最适pHpH值比游离酶的最值比游离酶的最 适适pHpH值要低一些。值要低一些。 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后多数酶固定化后热稳定性上升，最热稳定性上升，最 适温度也上升（有例外）。适温度也上升

31、（有例外）。 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性随载体的带电性 能变化。能变化。 固定化固定化载体载体与与底物电荷相反底物电荷相反, ,固定化酶的表固定化酶的表 观观K Km m值值降低降低。 固定化载体与底物电荷固定化载体与底物电荷相同相同, ,固定化酶的表固定化酶的表 观观K Km m值显著值显著增加增加。 VmVm固定化前后相同或接近固定化前后相同或接近 （也有例外）。（也有例外）。 固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化， 一般为：作用于一般为：作用于小分子底物的酶类小分子底物的酶类经固定化后，经固定化

32、后，专专 一性一性基本基本不变。不变。而既而既可作用大分子也可作用小分子可作用大分子也可作用小分子 底物的酶类底物的酶类经固定化后经固定化后专一性会发生变化。专一性会发生变化。 影响原因：影响原因： 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的 空间位阻空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使作用引起的。酶固定在载体上以后，使 大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降 低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响 较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不较小或不受影响，故与游

33、离酶的作用没有显著不 同。同。 四、固定化酶的应用四、固定化酶的应用 （1）乳制品中）乳制品中 乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛 奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不 能消化牛奶中的乳糖，能消化牛奶中的乳糖，-半乳糖苷酶：又称乳糖酶，半乳糖苷酶：又称乳糖酶， 可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。 采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于1977 年实现工业化。年实现工业化。 （2）在啤酒中）在啤酒中 糖化

34、需要糖化需要-淀粉酶淀粉酶，而麦芽中的，而麦芽中的-淀粉酶不足，淀粉酶不足， 需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续 通过通过固定化淀粉酶固定化淀粉酶反应器。例如，在制造啤酒时，可反应器。例如，在制造啤酒时，可 以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。 另外，采用另外，采用固定化蛋白质分解酶固定化蛋白质分解酶类来水解蛋白质类来水解蛋白质 或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有 的多酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主的多酚类和多肽结合

35、在一起，产生所谓冷浊。现在主 要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤 酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不 良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木 瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。 （3）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的 应用应用 固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一 种，它可以用来催

36、化玉米糖浆和淀粉生产高甜度种，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度 的高果糖糖浆。自的高果糖糖浆。自1972年这项技术产生以来，科年这项技术产生以来，科 学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的 葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今 后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固 定化酶定化酶 。 （4）在油脂改性中的应用）在油脂改性中的应用 脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应， 所以在油脂工业中有广泛应用，所以在油

37、脂工业中有广泛应用，1，3-特异性脂肪特异性脂肪 酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代 可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价 廉，因此这一工艺受到较大重视，已开展了较多工廉，因此这一工艺受到较大重视，已开展了较多工 作。作。 （5）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜 阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用 化学法合成。现在，已开始用酶法合成，化学法合成。现在，已开始用酶法合成， 用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴

38、 甜甜 。 （6）固定化酶在茶叶加工中的应用。）固定化酶在茶叶加工中的应用。 目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例 如，固定化的单宁酶和果胶酶。如，固定化的单宁酶和果胶酶。 单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中 的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改 善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶， 可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中 使用单

39、宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高 茶饮料品质。茶饮料品质。 果胶酶是作用于果胶质的果胶酶是作用于果胶质的D-D-半乳糖醛酸残基之间半乳糖醛酸残基之间 的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物 质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。 （7）在果汁中的应用）在果汁中的应用 柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的 重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬 苦素的二萜

40、烯二内酯化合物（苦素的二萜烯二内酯化合物（A环和环和B环）；另环）；另 一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附 法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质， 而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬 苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采 用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含 量。量。 2、医药领域的应用、医药领域的应用 （1）作为治疗药物）作为治疗药物 酶作为异体物质，反

41、复应用会导致免疫反应酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应 酶绝大多数是蛋白质，在体内易被网状内皮系酶绝大多数是蛋白质，在体内易被网状内皮系 统移除和被蛋白酶水解破坏。统移除和被蛋白酶水解破坏。 由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织 以达到治疗所需的最适高浓度。以达到治疗所需的最适高浓度。 溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法 将它们固定化以后就能逐一地加以解决。将它们固定化以后就能逐一地加以解决。 b. b. 除去除去( (一种或多种一种或多种) )氨基酸，使需要这些物质氨基酸，使需要这些物质 的病变

42、组织的病变组织“饿死饿死” 3、生物传感器、生物传感器 生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物浓生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物浓 度与可测量电信号关联起来的装置，生物传感器中研度与可测量电信号关联起来的装置，生物传感器中研 究最多的是酶传感器，其核心技术也是酶的固定化。究最多的是酶传感器，其核心技术也是酶的固定化。 ChenChen等将高聚物聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙烯等将高聚物聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙烯 酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜将葡萄糖氧化酶酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜将葡萄糖氧化酶 固定在金电极上，通过检测电信号可以测定血液中的固定在金电极上，通过检测电信

43、号可以测定血液中的 葡萄糖含量。宋正华等将具有分子识别功能的葡萄糖含量。宋正华等将具有分子识别功能的-葡葡 萄糖苷酶和发光胺，分别固定在壳质胺和大孔阴离子萄糖苷酶和发光胺，分别固定在壳质胺和大孔阴离子 交换树脂的填充柱中交换树脂的填充柱中, ,组成流动注射系统，可以方便组成流动注射系统，可以方便 地确定苦杏仁甙的含量。地确定苦杏仁甙的含量。 4、环境保护、环境保护 固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有 害物质，防止污染。其中害物质，防止污染。其中漆酶漆酶的固定化应用较为广的固定化应用较为广 泛，酚类化合物是废水中一类常见的高含量污染物，泛，酚

44、类化合物是废水中一类常见的高含量污染物， 漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧 化物酶。在废水处理中化物酶。在废水处理中,由于组分复杂而且经常变化，由于组分复杂而且经常变化， 利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因 此，要用多酶固定化体系组合处理，才能使有机物此，要用多酶固定化体系组合处理，才能使有机物 完全矿化和保持无害稳定排放。完全矿化和保持无害稳定排放。 将细胞限制或定位于特定将细胞限制或定位于特定 空间位置的方法。空间位置的方法。 被限定自由移动的细胞，即采被限定自由移动的细胞，即采

45、用各种方法固定在载体上，在一定的空间范用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。 一、基本概念一、基本概念 吸附法、包埋法吸附法、包埋法、交联法和无载体法、交联法和无载体法 优点：优点： 缺点：缺点： 最常用最常用 凝胶包埋法凝胶包埋法半透膜（胶囊）半透膜（胶囊） 包埋法包埋法 (2) 凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包 埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法。埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法。 凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻

46、酸钙凝胶、 角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 a. 琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法 b. 海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法 c. 角叉莱胶包埋法角叉莱胶包埋法 d. 明胶包埋法明胶包埋法 e. 聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法 琼脂琼脂水水 溶化溶化冷却至冷却至4855 加菌悬液加菌悬液 趁热分散在预冷的甲苯或四氯趁热分散在预冷的甲苯或四氯 乙烯溶液中，形成球状固定化乙烯溶液中，形成球状固定化 细胞胶粒。细胞胶粒。 摊成薄层，冷却，切成所需形状。摊成薄层，冷却，切成所需形状。 琼脂凝胶机械强度较差，氧气、底物和产物琼脂

47、凝胶机械强度较差，氧气、底物和产物 的扩散较困难，其使用受到限制。的扩散较困难，其使用受到限制。 海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法 海藻酸钠海藻酸钠 水溶液水溶液 灭菌灭菌 菌悬液菌悬液 滴入氯化钙溶液中，形滴入氯化钙溶液中，形 成球状固定化细胞胶粒。成球状固定化细胞胶粒。 海藻酸钙凝胶包埋法操作简便，条件温和，海藻酸钙凝胶包埋法操作简便，条件温和， 对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以 改变凝胶的孔径，改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化适合于多种细胞的固定化。 磷酸盐会使凝胶结构破坏，使用时应控制好磷酸盐会使凝胶结构破坏，使用时应控制好 培

48、养基中培养基中磷酸盐磷酸盐浓度，并在培养基中保持一定浓度，并在培养基中保持一定 浓度的浓度的钙离子钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。，以维持凝胶结构的稳定性。 角叉菜胶包埋法角叉菜胶包埋法 角叉菜胶角叉菜胶 水溶液水溶液 冷却至冷却至3550 加菌悬液加菌悬液 趁热滴定至趁热滴定至KCl溶液中，形成溶液中，形成 球状固定化细胞胶粒。球状固定化细胞胶粒。 滴到冷的植物油中，成型后再置滴到冷的植物油中，成型后再置 于于KCl溶液中。溶液中。 角叉莱胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，角叉莱胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低， 强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，强度不够时，可用戊二醛等交联

49、剂再交联处理， 进行双重固定化。进行双重固定化。 灭菌灭菌 明胶包埋法明胶包埋法 明胶水明胶水 溶液溶液 冷却至冷却至35以上以上 加菌悬液加菌悬液 冷却后制成所需形状。冷却后制成所需形状。 机械强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处机械强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处 理，进行双重固定化。理，进行双重固定化。 灭菌灭菌 聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法 丙烯丙烯 酰胺酰胺 甲叉双丙甲叉双丙 烯酰胺烯酰胺 混合混合 加过硫酸钙和四甲基乙二胺加过硫酸钙和四甲基乙二胺静置成型静置成型 固定化细胞机械强度高，可通过改变丙烯酰胺的浓度固定化细胞机械强度高，可通过改变丙烯酰胺的浓度 以调节

50、凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化。以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化。 菌悬液菌悬液 注意：丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作注意：丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作 用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减 少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间。少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间。 3、无载体法、无载体法 (1) (1) 基本概念：基本概念： 在没有载体的情况下，借助物理或在没有载体的情况下，借助物理或 化学方法，将细胞直接固定化的方法。这化学方法，将细胞直接固定化的方法。这 种固定化，既可发生在细胞结构上，也可种固定化，既可发生在细胞结构上，也

51、可 通过细胞聚集来完成。包括通过细胞聚集来完成。包括去自溶酶法去自溶酶法和和 絮凝法絮凝法。 三、固定化微生物细胞的特点：三、固定化微生物细胞的特点： （1）保持了其完整结构和自然状态，稳定性好。）保持了其完整结构和自然状态，稳定性好。 （2）细胞密度增大，能够提高产物产率。）细胞密度增大，能够提高产物产率。 （3）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用 较长时间。较长时间。 （4）保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调）保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调 控体系，可以按照原理的代谢途径进行新陈代谢，控体系，可以按照原理的代谢途径进行新陈代谢， 并进

52、行有效的代谢调节控制。并进行有效的代谢调节控制。 （5）提高工程菌的质粒稳定性，有利于菌种的传）提高工程菌的质粒稳定性，有利于菌种的传 代保存。代保存。 四、固定化微生物细胞的应用四、固定化微生物细胞的应用 电极活性测定型：电极活性测定型： 利用固定的微生物细胞的新陈代谢作用，测定利用固定的微生物细胞的新陈代谢作用，测定 电极活性物质的量的变化从而确定样品中欲测物质电极活性物质的量的变化从而确定样品中欲测物质 的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料 电池、离子选择电极和气体电极等组成。电池、离子选择电极和气体电极等组成。 微生物传感器已成功地用

53、于测定可发酵性糖，葡萄微生物传感器已成功地用于测定可发酵性糖，葡萄 糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、 氨、硝酸盐，生化需氧量氨、硝酸盐，生化需氧量(BOD)(BOD)、细胞数量等。、细胞数量等。 四、固定化植物细胞四、固定化植物细胞 吸附法吸附法包埋法。包埋法。 泡沫塑料的孔洞泡沫塑料的孔洞 或裂缝内或裂缝内中空纤维的外中空纤维的外 壁上壁上 琼脂琼脂角叉角叉 菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明 胶胶 (1) (1)提高植物细胞的提高植物细胞的存活率和稳定性存活率和稳定性 载体的保护可载体的保

54、护可减轻剪切力减轻剪切力和和其他外界因其他外界因 素素对植物细胞的影响对植物细胞的影响 更换不同的培养液更换不同的培养液以利于生产各种以利于生产各种 所需的次级代谢物。所需的次级代谢物。 反复使用反复使用连续使用较连续使用较 长一段时间长一段时间 产品的分离纯化产品的分离纯化 不容易聚集成团不容易聚集成团 固定化植物细胞主要用途是制造人工种子固定化植物细胞主要用途是制造人工种子 。 还可以用于生产各种色素、香精、药物、还可以用于生产各种色素、香精、药物、 酶等次级代谢物，一般仅酶等次级代谢物，一般仅适用于适用于可以可以分泌到分泌到 细胞外的产物的生产细胞外的产物的生产。对于细胞内产物，则。对于

55、细胞内产物，则 要想办法增加细胞透过性，使胞内产物分泌要想办法增加细胞透过性，使胞内产物分泌 到胞外。到胞外。 五、固定化动物细胞五、固定化动物细胞 1 1、动物细胞固定化方法：、动物细胞固定化方法： 主要为主要为吸附法吸附法与与包埋法包埋法 (1) (1) 吸附法：吸附法： 吸附法特别吸附法特别 适合于动物细胞的固定化适合于动物细胞的固定化 转瓶、微载体和中空纤维转瓶、微载体和中空纤维 a. a. 转瓶吸附：转瓶吸附： 玻璃玻璃塑料塑料 带上电荷带上电荷 b. b. 微载体吸附：微载体吸附： 带有表面带有表面 电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺

56、、聚苯 乙烯或玻璃等乙烯或玻璃等 生生 产产-干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介 素以及各种疫苗素以及各种疫苗 c.c.中空纤维吸附：中空纤维吸附： 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子 聚合物制成，聚合物制成，纤维管壁是半透膜纤维管壁是半透膜。 使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳 容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁培容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁培 养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解 氧和代谢产物透过中空纤维

57、膜进行传递。氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。 (2) (2) 包埋法：包埋法： 凝胶包埋法凝胶包埋法半透膜半透膜 包埋法包埋法 a. a. 凝胶包埋法：凝胶包埋法：利用各种利用各种多孔凝胶多孔凝胶为载体将动物为载体将动物 细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖 和新陈代谢，和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好由于有载体的保护，动物细胞有较好 的稳定性的稳定性可显著提高其存活率。可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼 脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。 琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法 12.5%琼脂糖琼脂糖 溶化溶化冷却至冷却至3738 加动物细胞加动物细胞 降温至降温至1O左右，得到直径为左右，得到直径为 0.10.3mm的微球状固定化细胞。的微球状固定化