胖大海种子超低温保存技术规程

1、ICS11.120.01C 23团 体 标 准T/CACM 00X2019胖大海种子超低温保存技术规程Technical procedures for cryopreservation of Sterculia lychnophora Hance seeds2019-0X-0X发布2019-0X-0X实施中华中医药学会 发布T/CACM 0012019目 次目 次I前 言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 保存种子的选择25 种子前处理26 种子保存量27 种子冷冻方式28 恢复培养2附录3参考文献4前 言本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构

2、和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所，中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，顾雅坤，符丽，谭红琼，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺。IIT/CACM 0012019胖大海种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了胖大海Sterculia lychnophora Hance种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于胖大海种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应

3、用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胖大海 Sterculia lychnophora Hance为梧桐科（Sterculiaceae）苹婆属（Sterculia Linn.）高大落叶乔木，又名大海子，因遇水膨大成海绵状而得名。其干燥成熟种子入药，味甘、性寒，具有清热润肺、润肠通便的功效，用于肺热声哑，干咳无痰，咽喉干痛等。收载于中国药典（20

4、15）。3.2胖大海果实 Sterculia lychnophora Hance fruits果实椭圆形或圆形，附有船型果荚，果实未成熟时其果荚为红色。3.3胖大海种子 Sterculia lychnophora Hance seeds胖大海的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子表面棕色或暗棕色，微有光泽，呈纺锤状或椭圆形，长23 cm，直径11.5cm，先端钝圆，基部略尖，具有浅色的圆形种脐。具不规则的干缩皱纹，外层种皮极薄，质脆，易脱落。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的胖大海种子置于液氮（-196）中保存。4 保存种子的

5、选择4.1 果实采收1月至3月，当果荚颜色变为褐色，且果皮由青色变成褐色时即可采收。果熟时要及时采收，否则种皮遇水容易膨胀发芽。去除果皮和杂质，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4 冰箱中保存备用（存放时间不超过10天）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照GB/T 3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法检测种子生活力。随机抽取30 粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2 爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC 溶液浸没种子，室温(25 )避光放置4 h 后观察染色结果。5.2 生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有

6、光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的胖大海种子生活力应90%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹胖大海种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为700:1，室温条件下干燥处理48 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由70%75%降至45%50%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量胖大海种子保存量不少于300粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式胖大海种子超低温保存的冷冻方式为

7、直接冷冻法，即将待保存的胖大海种子放入放入15 mL冻存管（每管78粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出4个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻2 min。8.2 冻后种子生活力检测取出2管解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力65%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下2管解冻后的胖大海种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度25 30 ，湿度70%85%条件下培养。 附录TTC的配制和保存方法精密称取TTC 1.00 g，溶于100 mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.57.5，置棕色瓶内4 冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08 g磷酸二氢钾溶于1 L无菌水中；溶液II：35.81 g磷酸二氢钠溶于1 L无菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸盐缓冲液）参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京，中国医药科技出版，2010,2452VIETNAM Gov.Strategy Develop of National Forestry from 2010 to 2020 and the vision to 2030. Hanoi Government