克隆及诱导蛋白步骤.doc

1、1 植物 RNA 提取 使用天根植物 RNA 快速提取试剂盒提取棉花 RNA ，详细步骤见说明书。 核酸分析仪分析 RNA 浓度1打开软件 ，选择 Nucleic acid ”；2擦拭加样处，用DEPC水清洗（1小之后点击OK”；3. 选择RNA ”，擦拭，再加1 p DEPC水作空白，点击Blank ”；4. 擦拭进样口，吸 1plRNA 样品，点击 “M easure ”,记录结果；5擦拭，吸取1 p DEPC水清洗进样孔，点击 Blank ”，再次进样，重复步骤4.6 .记录结果 :A260/A280；A260/A230； ng/plA260 是核酸最高吸收峰的吸收波长A280 是蛋白和

2、酚类物质最高吸收峰的吸收波长A230 是碳水化合物（糖类） 、盐类或有机溶剂的吸收波长A260/A280 的比值在 1.62.0 之间，表明没有蛋白质污染A260/A230 的比值在 2.02.4 之间，表明没有盐类小分子污染 剩余 RNA 放-80冰箱保存或继续进行试验2 基因克隆根据转录组及基因组注释的目的基因ORF序列，合并同源基因，设计了引RNA， cDNA物，以期获得全部家族基因。处理的棉花叶片提取反转录 天根快速反转录试剂盒合成第一链无 RNase 离心管1. 各试剂使用前混匀并短暂离心；42 c 3min后置于冰上。2. gDNA 去除体系，混匀，短暂离心，置于5 XBuffer

3、约 1500ng3 pl补足到15 pTotalRNARNaseFreeddH2O3pl4pl2pl7.5pl15pl2 步溶液中，混匀，并轻微离心；3. 反转录反应体系10 XFastRT BufferRTEnyme MixFQ-RT primer MixRNase - FreeTotal4. 取3混合液加到5.42 C孵育15min，95 C孵育3min放到冰上。得到cDNA用于后续试验。 -20 C保存。Taqmix10 dACT-jia nceF0.4 dACT-jia nceR0.4 dT1 dddH208.2 dTotal20PCR程序94 C4min94 C30s55 C30s7

4、2 C30s10 CPCR检测模板38cycles做胶，跑胶若条带在400-500bp之间，说明模板可用克隆，P基因或做荧光定量检测目的基因表达上调或下调。（实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量 分析的方法。检测方法I.SYBRGreen I法在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任 何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔

5、解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性2. TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从 而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物的形成完全同步。）做蛋白功能接下一步Pfu高保真酶5XHFBufferdNTPPfuFPRPTddH2OTotalPCR程序94 C94 CC72 C10 C5 p2.5 p0.5 p0.5 p0.5 p3 p13 p25 p4mi n30s30s35cyclessoo电泳

6、，若条带符合序列长度，则进行胶回收。胶回收1. 在紫外灯下切含目的的基因胶；2. 加 500 pl Buffer DE-A 混合后 75 C 68min 至胶熔化；3. 加250 p Buffer DE-B混合（目的片段v 400bp，加1体积异丙醇）变黄色， 准备DNA制备管，置于2ml离心管中；4. 吸取3中混合液于DNA制备管中，离心12000r/min，30s，弃滤液；5. 制备管重置2ml离心管，加 500 p Buffer W1（除去蛋白质），离心12000r/min，30s，弃滤液;6. 力卩700 p Buffer W2（除去离子、盐），离心12000r/min ， 30s，弃

7、滤液， 弃废液后以同样的方法再用 Buffer W2（除去离子、盐）洗涤一次，离心12000r/min， 1min，弃滤液；（确定在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇， 两次冲洗，使用Buffer W2能确保盐分被完全消除，消除对酶切反应的影响 ）7. 将制备管置回2ml离心管中，离心12000r/min，空离1min;8. 将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中加入 20 p去离子水 ddH2O,室温静置1min，离心12000r/min ， 1min,洗脱DNA。（将去离子水加热至65 C,提高洗脱效率）连接PEASY- T3（Blu

8、nt）连接快连4 dDNA|1 dT3载体 j吹打、离心室温连接30min,20min时拿感受态细胞（每支100 d,分两管使用） 转化1. 将trans 1-T1感受态细胞从-80 C冰箱中取出，置于冰上10min;2. 轻轻吸已连载体，打入50 d感受态细胞中；3. 冰上静置30min ；4.42 C热激45s，勿动;5. 冰上静置5min/2min ；6. 在超净台上向已经完成转化的离心管中加入500 dA LB液体培养基;7.37 C 200 rpm 1h涂板1. 取出已倒好的板（烧好玻璃棒，凉 30min ）;2. 取 10 dAmp +、40 dX-gal、40 dIPTG 在 1

9、.5ml 离心管中混匀；3. 分别取90 d于板上，涂匀；4. 取400 d已摇好的菌涂板；5. 先正置培养30min,再倒置培养12-16h ；6.4 C保存，以备后续试验I D拉差甘LB培养基1L1L400mL蛋白胨（Tryptone ）10g4g酵母提取物（Yeast extract ）5g2gNaCI10g4g琼脂粉（Agar powder,固体）15g(1.3-1.5%)6g蒸馏水定容至1L/400mL 。挑斑：加入200 d Amp+ LB于离心管中，用2.5 d枪枪头挑斑，一个枪头一 个斑，打入离心管中，每个板挑12个菌，摇菌12h。（挑白斑中等大小，相对在培养皿中部，与蓝斑相近

10、的斑，点的每个斑之间的 距离不要太近）菌液PCRTaqmix10 dM13FM13RddH20TotalPCR程序94 C0.4 pl0.4 p1 p8.2 p20 p6min（环状需要的时间长一些）30s.30s38cycles72 C2 min 丄oo10 CPCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物,转化全式金公 司Trans1-T1克隆感受态细胞,经菌液PCR检测后送公司测序。序列正确后以 备后续工作。3原核表达PCR扩增后,将扩增产物及pET-30a 分 切：别用引物序列中所示内10 XM Buffer切酶进行2 p_10 XM Buffer2 PL内切酶11 PL内切酶

11、11P_内切酶21 PL内切酶21P_GhTPS PCR 产物10 p_pET-30a10 PLddH2O6 PLddH2O6 P_Total volume20 P_Total volume20 PL金属浴中37 C消化2 h后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；(3)使用 AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit回收目的产物；（4）将回收的目的片段连接至pET-30a 片段:2 XT4 ligase Buffer5丄根据目的基因的ORF序列设计双酶切引物构建目的基因-pET30a融合表达 载体。GhTPS-pET30a融合表达载体构建的具体步骤如下：根据GhPS的ORF序列

12、（去信号肽）设计双酶切引物GhPS-F和GhPS-R,T4 DNA LigasepET-30a双酶切片段1丄GhTPS双酶切片段3丄Total volume10 丄慢连 金属浴中 16C 连接过夜 ;(5) 将连接产物转化到全式金公司 Trans1-T1 克隆感受态细胞中 , 菌液 PCR 检 测后 , 挑选阳性克隆送公司测序 ;(6) 测序正确的菌液提取质粒 , 转化到博迈德公司表达细胞 Rosetta (DE3) 中, 菌液 PCR 检测和测序后 , 在测序正确的菌液中加入甘油 , 保存菌种于 -20C 或 直接用于融合蛋白的诱导表达。3 使用 IPTG 诱导融合蛋白的表达 , 具体步骤如

13、下 :(1) 小量表达蛋白以确定最佳诱导 IPTG 浓度 :吸5让保存的菌种加入到5 mL Kan抗性的液体LB,恒温摇床中37 C, 220 rpm 过夜培养。第二天按 1:100 比例将菌液加入到 5 mL 新的 Kan 抗性液体 LB 中, 在恒温摇床中 37C, 220 rpm 培养 2-3 h 。当细胞达到对数生长期 , 加入不同 浓度的 IPTG 诱导蛋白表达 , 37C, 150 rpm 振荡培养 5-8 h。(2) 大量表达蛋白 :吸5丄保存的菌种加入5 mL Kan抗性的液体中，在恒温摇床中37 C, 220 rpm 过夜培养。第二天按 1:100 的比例将菌液加入到 400

14、 mL 新的 Kan 抗性液体 LB, 在恒温摇床中 37C, 220 rpm 培养 2-3 h 。当细胞达到对数生长期 ,按 1:1000 的比例加入400丄IPTG, 18 C, 150 rpm继续培养20 h。然后，10000 rpm, 4 C 离心 10 min, 倒掉上清 , 用 4mL 抽提缓冲液 extraction buffer (50 mM Mopso, pH 7.0, 5 mM MgCl 2, 5 mM sodium ascorbate, 0.5 mM PMSF, 5 mM dithiothreitol 和 10% v/v glycerol) 吹打悬浮菌体。超声波进行破碎

15、, 5 s 破碎一 次, 破碎 5 min, 然后 16000 rpm, 4 C 离心 20 min, 分别收集上清和包涵体。5 酶活性鉴定分别以NPP、GPP、FPP和GGPP为底物，Agile nt 2 ml的螺纹盖进样瓶中 加入下列反应体系 :Mops (pH 7.0, 200 mM)100 丄dithiothreitol (1 M)glycerol (100% v/v)200丄MgCl2 (100 mM)200丄MnCl2 (100 mM)NaWO4 (100 mM)4 pLNaF (500 mM)0.4 pLNPP/GPP/FPP/GGPP30/3.7/4.3/4.5 pLH2O50

16、0 pL1 mL216.3/242.6/242.0/241.8pL纯化的蛋白溶液Total volume加入500丄正己烷收集酶活产物，用封口膜密封进样瓶。恒温水浴锅30 C 水浴1 h。涡旋并离心，吸200此上清，使用0.22 pm有机滤膜过滤，转移至新 的进样瓶，封口膜密封，放入-20 C冰箱保存或直接吸取1丄进行GC-MS定性 与定量检测。6 GC-MS 分析方法使用岛津单四极杆气质联用仪 （GCMS-QP2010 SE） 进行挥发物定性定量 分析。毛细管柱为 Rxi-5Sil MS (30 m 0.25 mm 0.25 pm, RESTEK, USA)。载气为He,进样口温度为250 C,不分流,进样口流速和柱流速分别为10 mL/min和1 mL/min。进样量1也 程序升温为：40 C （保持1 min）以4 C /min升到130 C （保持 5 min）,