第七章 单倍体培养

1、第七章第七章 单倍体细胞培养单倍体细胞培养 n单倍体植物单倍体植物：体细胞中只具有配子染色体数 的个体，其基因型是半合子（Merozygote) 状态的，如使其染色体数加倍，便可直接成 为纯合的二倍体（双倍体）。 n单倍体培养单倍体培养：花药培养，小孢子培养和未受 精子房及卵细胞培养 主要内容主要内容 n单倍体种类单倍体种类 n单倍体的起源和遗传行为单倍体的起源和遗传行为 n单倍体的减数分裂单倍体的减数分裂 n单倍体的应用价值单倍体的应用价值 n花药培养花药培养 n花粉培养花粉培养 n雌配子诱导单倍体雌配子诱导单倍体 n单倍体细胞培养与植物育种单倍体细胞培养与植物育种 1单倍体种类单倍体种类

2、n一倍单倍体 n多倍单倍体 花药中分为：单倍体细胞和二倍体细胞，因而可花药中分为：单倍体细胞和二倍体细胞，因而可 用于单倍体培养用于单倍体培养。 混倍性的材料中很难分离单倍体。混倍性的材料中很难分离单倍体。 单倍体诱导受基因型影响单倍体诱导受基因型影响 雌性配子体诱导单倍体存在很多困难雌性配子体诱导单倍体存在很多困难 2单倍体的起源和遗传行为单倍体的起源和遗传行为 n单倍体的起源单倍体的起源 自发产生自发产生 诱发产生诱发产生 n诱发单倍体的方法诱发单倍体的方法 n种间和属间杂交 n物理照射和化学诱变 n双生苗的筛选 n花药和花粉培养 高等植物生活周期高等植物生活周期 中可产生单倍体有中可产生

3、单倍体有3 条途径条途径 3单倍体的减数分裂单倍体的减数分裂 n中期纺锤丝高度紊乱，后期染色体随机地分向两极 4单倍体的应用价值单倍体的应用价值 n在植物育种中使后代迅速纯合：用于杂交制种 n提高选择效率：比常规育种提高1倍效率 n排除杂种优势对后代选择的干扰：选择变异可代表真实变异 情况。 n遗传研究的良好实验材料体系：对数量遗传研究有很大用途 n突变体的筛选：隐性基因性状可表现出来 n消除致死基因：致死基因一表现出来就消除 n选育新型自交系：获得纯合自交系 n遗传转化的受体材料：获得的转基因材料可很快加倍纯合。 5花药培养花药培养 n我国花药培养起步晚，进展快，成果卓 著。我国研制的N6培

4、养基成为国际通用 培养基。 n花药培养的技术问题有很多有待解决,但 单倍体育种可缩短育种周期 花药培养 Mm（选择鉴别）2年 Mm 3年5代15年 自交6年 S1MM:2Mm:mm 自交鉴别纯度和性别 S2MM:2Mm:mm 自交 S3MM:2Mm:mm 3年 MM（纯雄） 有性杂交培养法（20年） M:Mm:mm M:mm MM（纯雄） 花药培养法（8年） 母本父本 F1 不同类型的卵细胞不同类型的花粉花药培养 自交 F2 自交 F3 淘汰选择 杂合Fn 纯系 鉴定或品比 常规杂交育种法 各种类型的单倍体植株 纯合的二倍体植株（纯系） 染色体加倍 株行鉴定 单倍体育种法 5.1花药培养的程序

5、和方法花药培养的程序和方法 n材料的选择材料的选择 n供体植株的基因型供体植株的基因型：春小麦比冬小麦容易些，粳稻比籼稻容 易培养，花药培养力从高到低：糯稻粳稻粳籼杂种籼 稻花粉植株诱导力是受材料孢子体（药壁）基因型的 控制 n供体植株的生理状态供体植株的生理状态：诱导力随植株年龄下降选用正常 生长季节的早期雄花或主穗及在最适宜温度条件下发育的花 药为材料田间生长的材料比温室材料好 n花粉发育时期：花粉发育时期：花粉胚性和非胚性 5.2预处理预处理 n低温法低温法 n在冰箱内冷藏 n可降低花药呼吸强度，减少物质消耗，延长花药寿命， 减少花粉的退化，使大多数花粉存活，利于小孢子从 配子体发育转向

6、孢子体发育 n其他方法其他方法 n乙烯利喷射植株，离心花蕾 n低剂量射线照射 5.3材料的消毒和接种材料的消毒和接种 n去掉培养瓶上的封口膜 n收集花药 n接种花药到培养基上 n接种完后，封口，包扎，写上记号 5.4诱导培养诱导培养 n要点要点 n诱导花粉去分化，启动花粉孢子体发育 n抑制花药体细胞组织（如药隔、药壁）的生长 n常用培养基常用培养基：MS(1962)、Nitsch(1969)、Miller(1963)、H(1967)、 B5(1968)、N6(1975)等 n激素添加和配比影响花粉发育途径 n蔗糖浓度通常很高，较高的浓度可使小孢子存活时间长 npH值有一定影响 n有机附加物有重

7、要作用:谷氨酰胺 5.5培养操作技术 n暗培养后再光培养暗培养后再光培养 n评价花药培养体系的好坏指标评价花药培养体系的好坏指标：压片或 切片观察，计算启动分裂的小孢子/总小 孢子，计算愈伤组织块数（胚数、植株 数）/花药（花蕾），一定时间内计算尚 有活力的小孢子数/总小孢子数 5.6影响花药培养的因素影响花药培养的因素 n供体植株的生长条件：供体植株的生长条件：需控光控温需控光控温 n供体植株的年龄：供体植株的年龄：多数情况下幼年植株优于老年，而甘蓝型油菜多数情况下幼年植株优于老年，而甘蓝型油菜 相反。相反。 n花粉发育时期：花粉发育时期：单核期或双核早期单核期或双核早期 n花蕾和花药的预处

8、理：花蕾和花药的预处理：低温处理、高温处理、激素处理、高低渗低温处理、高温处理、激素处理、高低渗 处理等处理等 n供体植株的基因型：供体植株的基因型：胚形成能力、愈伤组织诱导率、绿苗再生率胚形成能力、愈伤组织诱导率、绿苗再生率 等有差异等有差异 n培养基：培养基：激素种类和浓度、氮素使用量、有机物质、蔗糖浓度、激素种类和浓度、氮素使用量、有机物质、蔗糖浓度、 pH值高低、乙烯等值高低、乙烯等 n培养条件：培养条件：温度、光照、培养密度等温度、光照、培养密度等 n活性炭：活性炭：调节内源和外源生长物质的水平调节内源和外源生长物质的水平 5.7分化培养分化培养 n愈伤组织产生10-15天，可将其转

9、移到分化培养 基 n分化培养基要去掉2，4-D，加入一定量的Kt或 NAA或IAA，蔗糖浓度降至2-3 n分化芽需1-2周 n分化能力和愈伤组织的年龄有关 n花粉苗长出根后，可移植 5.8花药培养中的雄核发育途径和植株分化花药培养中的雄核发育途径和植株分化 n雄核发育花粉雄核发育花粉：花药培养中小孢子偏离配子体发 育途径的花粉 n雄核发育（小孢子发育）的主要途径雄核发育（小孢子发育）的主要途径（四条途径） n小孢子途径（B途径） n营养细胞发育（A途径） n生殖细胞发育（A-G途径） n由生殖细胞和营养细胞同时发育（C途径） 5.9花粉偏离正常发育途径的机理花粉偏离正常发育途径的机理 n花药壁

10、的作用花药壁的作用 n药壁组织对诱导形成愈伤组织、胚状体乃至绿苗的分化起一 定的作用 n花粉的二型性花粉的二型性 n在一个植物种或品种的花粉群体中，存在正常的和非正常的 两种花粉的现象称为花粉的二型性 n异常花粉发育的途径是A、B途径 n二核型花粉具雄核发育预成性 5.10花粉植株的分化产生花粉植株的分化产生 n胚状体发育途径胚状体发育途径（四种不同的起源） n小孢子发生的全部细胞参与胚状体形成 n小孢子发生的细胞由个别细胞发育形成胚状体，这种胚性细 胞具双极性 n小孢子发生细胞发育为愈伤组织，再发生胚状体 n小孢子发生细胞先游离为单细胞，再形成愈伤组织发生胚状 体 n愈伤组织再分化途径愈伤组

11、织再分化途径 5.11逆境处理对小孢子胚胎发生的诱导作用逆境处理对小孢子胚胎发生的诱导作用 n热激处理热激处理 n有效诱导孤雄生殖，产生热激蛋白 n射线处理射线处理 n可与热激处理结合，促进花粉愈伤形成和花粉胚胎发生 n秋水仙素处理秋水仙素处理 n扰乱了对不对称分裂起决定作用的微管细胞骨架，使单核花粉的细胞核移向中央， 导致均等分裂 n冷激处理冷激处理 n促进小孢子胚胎发生 n营养饥饿处理营养饥饿处理 n促进小孢子胚胎发生，可以和热激处理结合效果更好，糖饥饿处理对孤雄生殖有 诱导作用，谷氨酰胺饥饿处理也对一些植物有作用 n使雄配子体细胞质受抑制，启动营养细胞分化，使营养细胞脱离 G1状态进入S

12、期。 5.12孤雄生殖诱导的分子机理 nNapin基因表达与孤雄生殖过程一致 n单倍体胚胎发生前8h有大约18种蛋白质以很高的频 率合成。 n蛋白质的修饰比基因产物存在与否更重要 n花粉第一次分裂很多基因表现很高的转录活性 n封阻花粉特异基因的转录对烟草孤雄生殖的启动有 帮助作用 n孤雄生殖能力的丧失与“晚期基因”的表达相吻合。 n6花粉培养（小孢子培养）花粉培养（小孢子培养） 优点 可排除花药体细胞组织的干扰 可不经愈伤组织阶段，直接由胚状体形成花粉植株 可提高诱导频率 单倍体培养的两种方法 6.1花粉的分离和接种花粉的分离和接种 n自然释放法 n直接压挤法 n压挤-过滤-清洗法（只在茄科植

13、物和油菜上使用） n压挤 n过滤 n离心清洗 n接种 花粉的分离方法 6.2培养方法培养方法 n直接培养直接培养：液体浅层培养 n条件培养条件培养基培养 加入了花药提取物的基本培养基是条件培养基 n花药预培养法 n哺育培养（看护培养）哺育培养（看护培养） 利用整个花药、药壁或花瓣愈伤组织作为哺育者来诱导花粉去分化启动 n花药作为哺育组织 n花药与花粉间放入滤纸 n微室悬滴培养微室悬滴培养 n常用培养基：MS、N6、H、NLN等 6.3转移培养 n花粉不经愈伤组织而直接分化形成胚状 体 n花粉形成胚状体的途径 n营养核形成 n花粉直接分裂形成 n胚状体发育成小植株后，可转出移植 6.4花粉植株的

14、加倍及鉴定花粉植株的加倍及鉴定 n花粉植株的染色体加倍花粉植株的染色体加倍 n自然加倍 自然加倍通过核内有丝分裂实现或花粉核的融合；加倍频 率的高低受许多因素影响（植物激素、花药的发育时期、培 养时间长短） n人工加倍方法秋水仙碱处理加倍（但容易造成多倍化的嵌 合体） n培养瓶中加倍处理（处理单个单倍体细胞可降低混倍体和嵌合体现象） n移栽后加倍处理 n氟乐灵(Trifluralin)处理：比秋水仙素产生的不正常胚率低 6.5鉴定鉴定 n染色体数目鉴定染色体数目鉴定 n花粉植株的选择鉴定花粉植株的选择鉴定 nH1生长势差，生育期的表现与正常植株出入很大 n性状选择宜在H1代的种子后代群体中进行 6.6花药培养中的白化苗花药培养中的白化苗 n跟低温处理有关，特别是禾本科植物容易出现白化苗 n内部因素:基因型 花粉发育时期 n产生因素产生因素: n外部因素: 高温 激素浓度 延迟转分化培养时间 n控制大麦白化苗的措施控制大麦白化苗的措施: n同绿苗杂交后进行花药培养 n用BA在田间处理花药 n花粉发育时期取单核早、中期 n低温处理离体花药2-3周 n使用激素2，4-D配以少量2，4，5-T和BA，碳源改为麦芽糖