【原创】2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题背景课题背景 尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的农业重要的农业氮肥氮肥。 只有被土壤中细菌分解为只有被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸收利用才能被植物吸收利用 脲酶脲酶 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 课题课题2 2 土壤分解尿素的细菌的分土壤分解尿素的细菌的分 离与计数离与计数 1.从土壤中分离出从土壤中分离出 2.统计统计样品中究竟含有样品中究竟含有 课题目的课题目的 一、研究思路一、研究思路 (一一)筛选菌种筛选菌种 寻找耐高温的寻找耐高温的DNA 聚合酶聚合酶 耐高温耐高温的酶的酶耐高温耐高温生物体生物体耐高温耐高温环境（热泉、火山口

2、）环境（热泉、火山口） 寻找寻找 寻找寻找 Taq细菌细菌 筛选原理筛选原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 思考思考:1.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源 和氮源的分别是什么物质？和氮源的分别是什么物质？ 碳源碳源：葡萄糖、尿素：葡萄糖、尿素 氮源氮源：尿素：尿素 2.2.从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？于哪类培养基？ 固体培养基固体培养基选择培养基选择培养基 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？此配方能否筛选出产生

3、脲酶的细菌？为什么？ 原则上能。只有产生原则上能。只有产生脲酶脲酶的细菌能的细菌能利用尿素作为氮源利用尿素作为氮源而而 生存。生存。 该菌数量上升该菌数量上升 如何对细菌进行计数？ 101102103104 105106 方法方法 运用运用稀释涂布平板法稀释涂布平板法来来统计统计样品中的样品中的活菌活菌数。数。 原理原理 1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌 选择菌落数在选择菌落数在3030300300的平板上计数。的平板上计数。 需培养计算出需培养计算出三个或三个以上三个或三个以上的平板菌的平板菌 落落, ,求求平均数平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低

4、。 注意事项注意事项 看课本看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如 果有问题，错在哪？果有问题，错在哪？ 第一位同学：没有第一位同学：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 第二位同学：第二位同学：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值 计算公式：计算公式： 某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数 的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平 板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4 B

5、 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数 =（CV）M 阅读阅读P22P222323页页“（三）设置对照（三）设置对照”一段讨论教材中提出一段讨论教材中提出 的问题。的问题。 排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提 高实验结果的可信度。高实验结果的可信度。 (1)A(1)A同学出现此结果的可能原因？同学出现此结果的可能原因？ (2)(2)设置对照实验，帮助设置对照实验，帮助A A同学排除上述两个可能影响实验同学排除上述两个可能影响实验 结果的因素？结果的因素？ 这个实例可以看出，实验结果要有说服力，这个实例可以看出，实验结果要有说服力， 对照的设置是

6、必不可少对照的设置是必不可少 实验流程：实验流程： 样品稀释涂布平板样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 菌落计数菌落计数 二、实验设计 土壤取样土壤取样 制备培养基制备培养基 （一）土壤取样（一）土壤取样 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去先铲去 表层土表层土3cm3cm左右左右，再取样，将样品装入事先准备好的信，再取样，将样品装入事先准备好的信 封中。封中。 （二）制备培养基（二）制备培养基 制备制备选择培养基（尿素为唯一氮源）选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备制备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 相同的菌液，在牛肉

7、膏蛋白胨培养基上生长 的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因 此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判 断选择培养基是否起到了选择作用。 （三）样品稀释涂布平板（三）样品稀释涂布平板 稀释倍数为稀释倍数为 10101 1 10106 6。每个稀释度均用。每个稀释度均用3 3个选择培养基个选择培养基 和和1 1个蛋白胨培养基个蛋白胨培养基。 （四）微生物的培养与观察（四）微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

8、。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。 不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光 泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特 征，征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。 菌落菌落 菌落菌落 1 1、取土用的、取土用的小铁铲小铁铲的盛土样的的盛土样的信封信封在使用前都需要在使用前都需要灭菌灭菌。 2 2、应在、应在火焰

9、旁火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶 中，塞好棉塞。中，塞好棉塞。 3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁火焰旁操作。操作。 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三、操作提示三、操作提示 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1. 1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基 是否筛选出菌落？是否筛选出菌落？ 对照的培养皿对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染无菌落说明培养基没有污染。 牛肉膏培

10、养基的牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌菌落数目多余选择培养基的菌 落数目落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 2. 2.获得某一稀释度下，菌落数获得某一稀释度下，菌落数3030300300的平板，的平板， 在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相 接近？接近？ 相接近，说明操作成功。相接近，说明操作成功。 五、课题延伸五、课题延伸 巩固练习 1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要

11、的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分 别是别是( )( ) A.COA.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素 C C D D 3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、 M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相