培美曲塞囊泡纳米药物的制备

1、苏州大学本科生毕业设计本 科 毕 业 设 计（论 文）学院(部)材料与化学化工学部题 目培美曲塞囊泡纳米药物的制备年 级2014级专业功能材料班 级功能材料学号1409404024姓 名邓礼良指导老师钟志远 教授论文提交日期2018年05月目 录中文摘要1Abstract2第一章 前言3第二章 实验部分52.1 材料与试剂52.2 PEG-P(TMC-DTC)聚合物囊泡的制备62.3 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选62.3.1 不同Hepes缓冲溶液的筛选62.3.2 不同的缓冲液pH值的筛选72.3.3 不同的制备温度与转速的筛选72.3.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的筛选72.3.5 不同

2、的钙离子浓度的筛选以及理论载药量的筛选72.3.6 透析与过柱方法的筛选8第三章 结果与讨论93.1 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选93.1.1 不同Hepes缓冲溶液的影响93.1.2 不同的缓冲液pH值的影响93.1.3 不同的制备温度与转速的影响103.1.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的影响103.1.5 不同的钙离子浓度的筛选以及理论载药量的影响113.1.6 透析与过柱的影响11参考文献15致谢16培美曲塞囊泡纳米药物的制备中文摘要培美曲塞（PEM）是一种叶酸拮抗剂，是多靶点抗肿瘤药物，在许多实体瘤包括恶性胸膜间皮瘤中具有良好的临床抗肿瘤活性。然而，PEM在单独使用时体内抗肿瘤活性低

3、，这可能是其细胞穿透能力差、生物利用度低，或是剂量限制性副作用。为了克服这些问题并获得有效的抗肿瘤活性，本论文研究了聚合物囊泡作为纳米药物载体来制备PEM囊泡纳米药物。聚合物囊泡作为纳米药物载体面临着许多挑战，如囊泡粒径不合适、囊泡载药量不理想或制备繁琐等。本论文主要对PEM囊泡纳米药物的主动装载药物进行了探索，优化了不同制备条件。利用动态光散射粒度仪和紫外-可见分光光度计分别测定在不同条件下制备的囊泡纳米药物的粒径大小和载药量，探究不同的条件对囊泡的粒径和载药量的影响，并且优化制备条件使得囊泡纳米药物的粒径和载药量能同时较为理想。关键词：培美曲塞，囊泡，主动装载，抗肿瘤作者： 邓礼良 指导教

4、师： 钟志远 教授AbstractPemetrexed (PEM) is a multi-targeted antifolate drug with good anti-tumor activity in many solid tumors including malignant pleural mesothelioma (MPM). However, PEM does not show sufficient anti-tumor activity in vivo when used alone, possibly due to insufficient cell penetration le

5、ading to low bioavailability or dose-limiting side-effects. To overcome these problems and obtain effective anti-tumor activity, in this thesis we prepared PEM polymersomal nanomedicines by applying polymersomes as nanocarriers to encapsulate PEM. As drug nanocarriers, polymersomes face many challen

6、ges, such as improper size, unsatisfactory drug loading content or complicated preparation procedure. This thesis mainly explored and optimized the preparation conditions of PEM polymersomal nanomedicines using active loading method. Dynamic light scattering particle size analyzer and UV-visible spe

7、ctrophotometer were used respectively for the determination of polymersome size and drug loading content of the prepared polymersomal nanomedicines. The effects of different preparation conditions on the size and drug loading contents were investigated and preparation conditions for obtaining ideal

8、polymersome size and drug loading content at the same time were screened.KEY WORDS: pemetrexed, vesicles, active loading, anti-tumorWritten by: Liliang Deng Supervised by: Prof. Zhiyuan Zhong第一章 前言 聚合物囊泡自从上个世纪后期开始，很多人投入了相关的研究工作，尤其是近年来，人们发现囊泡可以作为有效的纳米药物载体，这也吸引了越来越多的研究者的关注。囊泡是由两亲性分子，在水相中自组装形成的具有双层膜结构的

9、分子有序结合体。双亲性共聚物在水溶液中通过自组装而形成的聚合物囊泡具有中空结构的内腔，该内腔与外界水介质被聚合物膜隔离开。聚合物囊泡的结构与脂质体囊泡的结构相似，同时与脂质体囊泡相比也具有强大的优势，例如分子量比较高，所以可以形成更加厚而稳定的聚合物膜、可在很大范围内设计或选择聚合物带来的性质可调的聚合物膜，而且聚合物囊泡在装载亲水性或疏水性药物中能发挥重要作用。 近年来，世界各地的癌症发病率和死亡率均逐年上升，这不仅严重威胁人类的健康，同时也对社会和经济的发展造成了沉重的负担。目前临床上治疗癌症的主要方法还是手术切除、放射治疗、化学治疗。其中化疗药物虽能直接抑制肿瘤生长、运用广泛，但是由于抗

10、癌药物并不具有选择性，因此无法识别癌细胞和正常细胞，对人体有很强的系统毒性。例如疏水性抗癌药物（如紫杉醇、阿霉素和5-氟尿嘧啶等）由于水溶性差，通常生物利用度比较低；而亲水性抗癌药物（如盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、硫酸长春新碱和生物药物等）的体内循环时间短、肿瘤穿透性差。因此目前急需找到安全有效的载药的方法。目前已经开始探索的纳米药物载体诸如脂质体、聚合物胶束等粒径在 20-200 纳米，能有效提高疏水药物的溶解性、提高药物在肿瘤处的富集量、改变药物的体内分布，进而提高药物的生物利用率、减小毒副作用。到目前为止，已有 12 种纳米药物被批准临床使用，1000多种已进入不同阶段的临

11、床试验中1。如前所述，聚合物囊泡同时具有脂质体和聚合物胶束的优点，不仅可以装载疏水药物，还能装载并且保护亲水药物，效果比脂质体更好，为亲水性抗癌药物的装载、靶向治疗肿瘤带来了福音。在全世界范围内，世界各国的研究者们已经在聚合物囊泡纳米药物方面开展了很多前沿性的工作，针对纳米药物应用的各个重要步骤，开发了各种类型的囊泡，其中包括刺激响应性囊泡、循环稳定的囊泡、肿瘤主动靶向囊泡、具有不对称膜型囊泡、生物可降解囊泡等众多功能性囊泡，为囊泡纳米药物的临床推进奠定了坚实的基础。药物载体是一种能改变药物进入人体内的方式和在人体内的分布，同时可以控制药物释放的体系。该体系可防止药物短时间降解、失活、排泄以及

12、发生人体免疫反应2。为了寻找合适的药物载体，研究者们对蛋白质、脂质体以及单克隆抗体等各种体系进行了大量研究。其中表面活性剂缔合形成的多种分子有序组合体如胶束、微乳液、液晶及囊泡等，具有包载药物分子的能力以及与生物膜的良好相容性和渗透性，成为药物载体的重要研究领域3-4。囊泡是由两亲性分子，如天然的、合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团的磷脂，分散于水中自发形成的一类具有封闭双层结构的分子有序结合体5。与从低分子量脂质体自组装而成的脂质囊泡不同，聚合物囊泡是由具有双亲结构的嵌段共聚物、接枝共聚物或树枝状聚合物自组装形成的一类高分子聚集体。聚合物囊泡具有稳定性高、通透性可设计以及可进一步功能化修饰

13、等优点，可作为一种疾病诊断、药物输送、微反应器等的新型多功能工具6-9。此外，聚合物囊泡所具有疏水性的膜及巨大的亲水性的内腔，使其具有同时运载亲、疏水性药物的能力。聚合物囊泡的双层膜结构与细胞膜之间有良好的相容性，因此可以成为理想的体内药物输送载体。培美曲塞（Pemetrexed，商品名Alimta）是一种含有吡咯嘧啶基团的叶酸拮抗制剂，它可以破坏细胞内叶酸参与的代谢过程，从而达到抑制细胞复制，抑制肿瘤的生长的效果。体外研究表明，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的活性，这三种都是合成叶酸所必需的酶。培美曲塞是礼来公司推出的抗癌新药，已获美国食品和药品管理局

14、（FDA)的批准在临床上与顺铂联合用于恶性胸膜间皮瘤的一线治疗，但是在直接使用时，生物利用率很低，因此需要我们找到合适的药物载体以提高其生物利用率。本实验中，我们通过两嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚（三亚甲基碳酸酯-co-1,2-二硫戊环三亚甲基碳酸酯）（PEG-P(TMC-DTC)）自组装制备的还原敏感聚合物囊泡，用于装载多靶点抗叶酸药物PEM。探索在不同的制备条件对聚合物囊泡本身的影响，以及对囊泡载药情况的影响。第二章 实验部分2.1 原料与试剂表1药品及规格药品名称规格公司聚乙二醇单甲醚(PEG-OH)Mn=5.0 kg/molFluka双硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）纯度99%根据实验室报

15、道的文献合成N, N-二甲基甲酰胺（DMF）纯度99%国药集团二甲基亚砜（DMSO）纯度99%国药集团十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）纯度99%国药集团二水合磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）纯度99%国药集团醋酸钙Ca(CH3COO)2纯度99%国药集团N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（Hepes）纯度99%国药集团仪器：核磁共振氢谱（1H NMR）由 400 MHz 超导核磁共振谱仪（Unity Inova，美国瓦里安）测定，氘代氯仿（CDCl3）为溶剂，化学位移以溶剂峰为参考标准。聚合物分子量以及分子量分布由凝胶渗透色谱仪（GPC）测定，使用 Waters 151

16、5 高效液相色谱仪，RI 2410 示差折射率指数检测器和 PL-Gel （500 and Mixed C）凝胶柱并辅以保护柱，以 DMF 为流动相，流动速率为 0.8 mL/min，温度为 40 C，采用一系列单分散线性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为标样来校正柱子。胶束粒径和粒径分布通过 Zeta sizer Nano-ZS 动态光散射仪（英国 Malvern公司）测定，温度为 25 C，采用 He/Ne 激光光源和背折射检测器，波长为 633 nm。2.2 PEG-P(TMC-DTC)聚合物囊泡的制备在本实验中，我们使用PEG-P(TMC-DTC）制备聚合物囊PEG-P(TMC-DTC）

17、的结构式如图2.2.1。实验温度保持25，100 L（10 mg/mL）PEG-P(TMC-DTC）的DMSO溶液通过移液器迅速打入到以200 rpm速度搅拌的Hepes缓冲液（10 mM）中先形成空囊泡，再用HAc/NaAc缓冲溶液（0.4 M）调节pH至4.5，这样就形成了pH梯度。然后在200 rpm的转速下加入PEM的水溶液（5 mg/mL），使得理论载药量分别为9.1 wt%和18.0 wt%。将此分散液放入 37 ，200 rpm 摇床中放置过夜，室温下在 PB（10 mM, pH 7.4）中透析8小时（Mw 3500）以除去有机溶剂和游离的未被包裹的药物。图2.2.1 PEG-P

18、(TMC-DTC）结构式（m =5000 , x =15000 , y = 2000）2.3 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选2.3.1 不同Hepes缓冲溶液的筛选在实验的初期阶段，探究溶解不同离子的Hepes溶液对囊泡的形成有何影响，我们尝试了在Hepes溶液中分别加入铝离子和铁离子，在此之前我们一直在Hepes溶液中加入醋酸钙。在此我们使用实验室备有的氯化铁和碱式乙酸铝，往40 mL的Hepes溶液中加入108 mg氯化铁（分子量270），在40 mL的Hepes溶液中加入64.8 mg碱式乙酸铝（分子量162）。同时我们也尝试往Hepes溶液中加入柠檬酸三钙，将76 mg柠檬酸三钙（分

19、子量570）加入到40 mL的Hepes溶液中。2.3.2 不同的缓冲液pH值的筛选在对含不同离子的Hepes缓冲溶液进行筛选之后，我们开始尝试不同pH值的Hepes缓冲溶液来制备聚合物囊泡，探究不同的pH条件对囊泡的影响。在此次试验中，我们将Hepes溶液的pH值分别调节至7.0，7.4和8.0，然后用三种Hepes溶液分别制备聚合物囊泡，制备方法除pH值改变以外，其余步骤皆与2.2中所述的制备方法相同。2.3.3 不同的制备温度与转速的筛选在探究了不同的缓冲液条件对囊泡制备的影响之后，我们开始探究制备过程中的条件对制备的聚合物囊泡的影响。我们认为在制备过程中影响囊泡的主要条件应该是制备时的

20、转速的温度，因此我们决定探究这两个主要条件的影响。在此实验中，我们选择的温度条件分别为25 ，30 ，37 和40 ，制备时的转速则选择200 rpm，280 rpm，400 rpm，600 rpm，800 rpm和1000 rpm。我们分别在这些不同的条件下制备聚合物囊泡，同时进行囊泡载药以检测载药效率。制备聚合物囊泡的方法除需要筛选的条件，其余条件与步骤皆与2.2中所述的制备方法相同。2.3.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的筛选在筛选出合适的制备温度和转速之后，我们开始尝试各种方法来尽量提高囊泡的载药量和包封率。在此实验中，我们考虑钙离子在制备囊泡以及载药之后不会再对提高载药量和包封率有正面影

21、响，于是便决定在制备完成之后，使用螯合剂除去钙离子，从而确定囊泡外介质中的钙离子是否会降低载药量和包封率。同时，我们还探究了聚合物溶剂对囊泡的影响，我们分别使用DMSO和DMF来溶解PEG-P(TMC-DTC)，并分别制备聚合物囊泡。制备方法同2.2。2.3.5 不同的钙离子浓度的筛选以及理论载药量的筛选在之前的实验中发现螯合剂影响很小之后，我们再次针对钙离子进行了一系列实验，此次我们考虑钙离子的浓度也有可能会影响囊泡的制备，于是我们便分别配制了钙离子浓度为10mM，20mM和30mM的Hepes溶液，并且分别用三种溶液制备聚合物囊泡。与此同时，我们还考虑到在囊泡载药时加入的药物的量也可能会影

22、响到囊泡的载药情况，因此我们也同时探究理论载药量对囊泡载药的影响。制备方法同2.2。2.3.6 透析与过柱方法的筛选在之前的实验中，为避免残留药物的影响，我们一直是采用透析的方法，利用透析袋内外浓度差除去未被载入囊泡的PEM，在透析之后使用紫外分光光度计检测囊泡对药物的包封率和载药量。然而我们也一直在考虑利用浓度差来除去残留药物是否会无法去除干净，因此我们决定尝试使用过柱的方法来除去残留的PEM。在使用过柱方法的实验中，我们使用的柱填料为G25葡聚糖。因为实验是在探究钙离子影响之后开展的，所以在此实验开始时，我们也使用了不同钙离子浓度的Hepes溶液来制备聚合物囊泡，也再一次确定钙离子浓度的影

23、响。另外，考虑到柱体的吸附问题之后我们便又进行了一系列实验，我们开始尝试将聚合物囊泡和PEM物理混合，将物理混合溶液进行过柱，在这一阶段我们尝试使用不同的流动相进行过柱，我们使用了10 mM的PB缓冲溶液和HAc/NaAc缓冲溶液进行过柱。最后，我们使用了50 mM的PB缓冲溶液作为流动相进行过柱。第三章 结果与讨论3.1 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选3.1.1 不同Hepes缓冲溶液的影响经过尝试我们发现，氯化铁和碱式乙酸铝的溶解度很低，难溶于pH值为8.0的Hepes溶液之中。同时在使用柠檬酸三钙之后，我们发现柠檬酸三钙也同样难溶于Hepes溶液之中，因此我们在后面的实验之中将继续沿用

24、之前的方法，在Hepes溶液之中加入醋酸钙以加入钙离子。3.1.2 不同的缓冲液pH值的影响通过对三种条件下制备的聚合物囊泡进行检测（表3.1.2.1），制备的聚合物囊泡粒径图如图3.1.2.1，由图表可知，pH值8.0条件下制备的聚合物囊泡的包封率和载药量比在pH 7.0和pH 7.4条件下制备的聚合物囊泡要好。因此，pH 8.0为目前我们已知的制备聚合物囊泡的最适pH值。图3.1.2.1 聚合物囊泡粒径图表3.1.2.1 不同pH条件下聚合物囊泡的表征Size(d.nm)PDIDLE(wt%)DLC(wt%)pH:7.095.40.14494.5pH:7.0130.50.15726.4pH

25、:7.0120.30.13676.2pH:7.4128.00.14776.9pH:7.4121.20.15706.8pH:7.4136.60.12837.5pH:8.0128.10.15787.0pH:8.0133.00.11877.8pH:8.0116.80.14696.23.1.3 不同的制备温度与转速的影响通过检测我们发现在给定的温度梯度内，聚合物囊泡的粒径会随温度升高先减小然后增大。而在给定的转速内，聚合物囊泡的粒径会随转速增大而减小（表3.1.3.1）。表3.1.3.1不同的温度和转速下聚合物囊泡的表征温度()转速(rpm)Size(nm)PDIAbsDLE(%)DLC(wt%)30

26、2001240.120.354625.6302801190.110.297524.7304001100.140.287474.3306001020.160.252433.930800940.120.244413.7301000870.150.114181.6252801270.150.346615.5302801020.160.280484.4372801160.110.301504.6402801160.150.289504.6同时通过检测不同条件下制备的聚合物囊泡，我们发现最佳制备温度为25，而制备聚合物囊泡的较适合的转速则是200rpm。所以我们在接下来的实验中制备聚合物囊泡的条件均会选

27、择25，200rpm。3.1.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的影响通过检测，我们发现是否加入螯合剂除去钙离子对囊泡的载药量和包封率影响很小。同时，我们发现以DMF作为溶剂溶解的聚合物制备的聚合物囊泡粒径很小（表3.1.4.1）。在实验初期，我们认为制备的囊泡的粒径应该尽量小，因为囊泡粒径越小越容易在生物体内运输，也就越容易到达癌细胞处发挥药效，抗癌药的副作用也会更小，但是在一系列实验之后我们发现，粒径过于小的囊泡载药量和包封率都非常低，无法达到我们的要求，因此我们放弃了使用DMF作溶剂溶解PEG-P(TMC-DTC)，在今后的实验中，我们都将使用DMSO作为溶剂溶解PEG-P(TMC-DTC)。表

28、3.1.4.1 加入螯合剂，不同聚合物溶剂制备聚合物囊泡表征聚合物溶剂Size(nm)PDIAbsDLE(%)DLC(wt%)DMSO870.130.13725.62.32DMSO1030.130.16430.12.74DMSO960.110.14026.42.40DMSO890.150.14927.12.47DMF780.190.11119.71.79DMF800.210.09516.51.50DMF840.180.11118.21.653.1.5 不同的钙离子浓度以及理论载药量的影响通过对比实验的检测结果，我们发现钙离子浓度对囊泡的粒径和载药影响很小，而理论载药量的量增大时，会略微增长囊泡

29、的载药（表3.1.5.1），而由于投入的量多，包封率和载药量的数值反而减小，所以流失的PEM也变得更多。在后续的实验中，我们也仍然选择投入PEM量为10%。表3.1.5.1 不同在钙离子浓度和投入PEM量制备的聚合物囊泡药物表征Ca2+浓度投入PEMSize(nm)PDIAbsDLE(%)DLC(wt%)20mM10%1230.240.40366.86.020mM18%960.190.33226.74.830mM10%1080.200.29147.74.330mM18%970.150.35228.85.23.1.6 透析与过柱对聚合物囊泡的影响通过对比过柱前后对囊泡的检测结果（表3.1.6.1

30、），我们发现与透析的结果相似，在过柱之后，囊泡的粒径会比过柱之前小。同时我们也发现，在过柱之后，囊泡的包封率和载药量都不是很理想（表3.1.6.2），而且经过计算我们发现，在过柱之后回收到的PEM的量很少，药物的回收率偏低，于是我们便在这一阶段重复了几次实验，使用同一根柱子对不同批次的样品进行过柱，然后分别检测，得到的结果与这一结果相似，都在过柱之后检测到载药情况较差，而且药物的回收率也同样很低。于是我们开始考虑可能是柱子的填充物对PEM产生吸附或者流动相的影响，从而导致PEM残留在柱子内无法顺利流出。表3.1.6.1 过柱前后聚合物囊泡的表征Ca2+浓度Size 1（nm）PDI 1Size

31、 2（nm）PDI 20 mM1180.161020.1510 mM1080.16950.2020 mM1030.16880.1530 mM1100.15940.15Size 1 :柱前粒径，Size 2 :柱后粒径；PDI 1 :柱前PDI值 PDI 2 :柱后PDI值表3.1.6.2过柱后囊泡的载药表征Ca2+浓度AbsDLE(%)DLC(wt%)0 mM0.31521.91.910 mM0.36725.72.320 mM0.43130.32.730 mM0.30721.41.9使用10 mM的PB缓冲溶液和HAc/NaAc缓冲溶液作为流动相时得到的结果都与上述结果相似，药物的回收率低，聚

32、合物囊泡的包封率和载药量不高，直至我们使用50 mM的PB缓冲溶液作为流动相进行过柱，发现分离效果较好，于是便使用50 mM的PB缓冲溶液进行过柱，然后逐个检测从而制作聚合物囊泡的流出曲线和PEM的流出曲线谱图。我们由于收集的体积不足，导致一直没有完成，直至最后两次实验，终于发现在聚合物囊泡流出后20 mL开始出现PEM的紫外吸收峰，从而确定在聚合物囊泡流出后20 mL处PEM开始流出，通过检测到的囊泡数量和PEM的紫外吸收制作出曲线图（图3.1.6.1）。图3.1.6.1 过柱流出曲线通过分析，我们发现此条件下过柱聚合物囊泡和PEM的分离效果较好，同时由计算得知回收到的PEM量接近投入的量，

33、PEM的回收率达到95%，由此可知，柱体并未对PEM产生吸附，过柱是可以使用的方法。为了进一步确认上述结果，我们还制备囊泡后化学载药，然后再次过柱，并且同样的逐个检测制作流出曲线，得到与上述曲线图相似的曲线（图3.1.6.2）。图3.1.6.2 过柱流出曲线由此实验结果可知，过柱的方法可以达到较好的分离效果，并且药物不会被柱体吸附，过柱不会对囊泡的载药产生影响，之后仍然可以采用过柱的方法除去未被囊泡载入的PEM。经过一系列的实验，我们对囊泡纳米药物的制备条件进行了筛选，探究各种条件对囊泡纳米药物的影响。在实验过程中，我们发现制备聚合物囊泡的各种条件中，对聚合物囊泡影响较大的因素是制备囊泡的温度

34、和转速，因此我们也一直在寻找最合适的制备条件制备理想的囊泡，制备温度25，转速200 rpm下制备的囊泡的粒径和PDI数值都较符合我们的要求，并且载药情况也较好。在囊泡载药方面，我们发现对囊泡载药情况最大的影响因素是囊泡本身的粒径，而不是外在的条件，囊泡的粒径较大时，囊泡的载药情况也会较好，而在制备的囊泡粒径过小时，囊泡的载药量会明显降低。因此我们无法一味追求囊泡的粒径小，只能寻找一个适中的条件，使得囊泡的粒径适中以保证囊泡的载药情况较好。22参考文献1 A. Jemal, F. Bray, M.M. Center, J. Ferlay, E. Ward, D. Forman, Global

35、cancer statistics, CA: A Cancer Journal for Clinicians 2011, 61 (2), 134.2 Li N, Zhuang C Y, Wang M, et al. Liposome coated with low molecular weight chitosan and its pot- ential use in ocular drug deliveryJ. Int J pHarm, 2009, 379: 131-138.3 Rosa M, Infante M R, Miguel M G, et al. Spontaneous formationof vesicles and dispersed cubic and hexagonal particles in aminoacid-based catanionic surfactant systemsJ. Langmuir, 2006, 22:5588-5596.4 Buyens K, Demeester J, De Smedt S S, et al. Elucidat