DNA测序技术及其应用PPT学习教案

1、会计学1 DNA测序技术及其应用测序技术及其应用PPT课件课件 引言引言 测序技术的应用与展望测序技术的应用与展望 第一代测序技术第一代测序技术 第二代测序技术第二代测序技术 第1页/共64页 第2页/共64页 人类基因组计划（人类基因组计划（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP） 于于19901990年正式启动，其主要目标有：识别人类年正式启动，其主要目标有：识别人类 DNADNA中所有基因（超过中所有基因（超过1010万个）；测定组成人类万个）；测定组成人类 DNADNA的的3030亿碱基对的序列亿碱基对的序列；将这些信息储存到数；将

2、这些信息储存到数 据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解 决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。 已于已于20032003年完成。年完成。 人类基因组计划是当代生命科学一项伟大人类基因组计划是当代生命科学一项伟大 的科学工程，它奠定了的科学工程，它奠定了2121世纪生命科学发展和世纪生命科学发展和 现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上 的巨大意义和商业上的巨大价值。的巨大意义和商业上的巨大价值。 第3页/共64页 测序技术最早可以追溯到测序技术最早可以追溯到20世纪世

3、纪50年代。年代。 早在早在1945年就已经出现了关于早期测序技术的年就已经出现了关于早期测序技术的 报导，即报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核等用化学降解的方法测定多聚核 糖核苷酸序列。糖核苷酸序列。19771977年年Sanger等发明的双脱氧核苷等发明的双脱氧核苷 酸末端终止法和酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，等发明的化学降解法，标志标志 着第一代测序技术的诞生着第一代测序技术的诞生。 此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测 序技术，包括序技术，包括Roche公司的公司的454技术技术、Illumina公司公司

4、的的SolexaSolexa技术技术和和ABI公司的公司的SOLiD技术技术。 第4页/共64页 最近，最近，Helicos公司的单分子测序技术、公司的单分子测序技术、 Pacific Biosciences公司的单分子实时公司的单分子实时( (Single Molecule Real Time, SMRT) )测序技术和测序技术和 Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的公司正在研究的 纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技 术。术。 测序技术正在向着高通量、低成本、长读测序技术正在向着高通量、低成本、长读 取长度的方向

5、发展。取长度的方向发展。 第5页/共64页 第6页/共64页 第7页/共64页 第8页/共64页 第9页/共64页 第10页/共64页 第11页/共64页 第12页/共64页 P OH dNTP ddNT P P OH OH P P P P O H 第13页/共64页 第14页/共64页 第15页/共64页 第16页/共64页 3730 全自动 测序仪 第17页/共64页 第18页/共64页 第19页/共64页 第一代测序技术在分子生物学研究中发第一代测序技术在分子生物学研究中发 挥过重要的作用挥过重要的作用, ,如人类基因组计划如人类基因组计划(human (human genome pro

6、ject,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA测测 序技术。目前基于荧光标记和序技术。目前基于荧光标记和SangerSanger的双脱的双脱 氧链终止法原理的氧链终止法原理的荧光自动测序仪荧光自动测序仪仍被广泛仍被广泛 地应用。地应用。 第20页/共64页 第21页/共64页 基因组基因组DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA） 构建构建ssDNAssDNA文库文库 测序测序 （聚合酶合成测序聚合酶合成测序，连接酶合成测序连接酶合成测序） 由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行由于所有的克隆都在同一平面上，这

7、些反应就能够大规模平行 进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行， 从而获得测序数据。从而获得测序数据。DNADNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计 算机分析就可以获得完整的算机分析就可以获得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 第22页/共64页 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、荧光荧光 素酶素酶和和双磷酸酶双磷酸酶的作用下，将每一个的作用下，将每一个 的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来 ，通过检测化学发光信号的有无和强度，达，

8、通过检测化学发光信号的有无和强度，达 到实时检测到实时检测序列的目的。序列的目的。 第23页/共64页 硫化酶硫化酶 荧光素酶荧光素酶 第24页/共64页 第25页/共64页 指示器指示器 相机相机 PTPPTP盒盒 第26页/共64页 454 454测序法的突出优势是测序法的突出优势是较长的读长较长的读长，目，目 前前GS FLXGS FLX测序系统的序列读长已超过测序系统的序列读长已超过400 bp400 bp。 虽然虽然454454平台的测序成本比其他新一代测序平平台的测序成本比其他新一代测序平 台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，台要高很多，但对于那些需要长读长的应用， 如从头测序

9、，它仍是最理想的选择。如从头测序，它仍是最理想的选择。 缺点是缺点是无法准确测量同聚物的长度无法准确测量同聚物的长度。 第27页/共64页 Illumina公司的新一代测序仪公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由最早由 Solexa公司研发，利用合成测序公司研发，利用合成测序( (Sequencingby Synthesis) ) 的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。 原理：原理： 将基因组将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻的随机片段附着到光学透明的玻 璃表面（即璃表面（即Flow cell），这些），这些DNA片段经

10、过延伸和片段经过延伸和 桥式扩增后，在桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿上形成了数以亿Cluster， 每个每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然是具有数千份相同模板的单分子簇。然 后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通 过可逆性终止的过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测（边合成边测序）技术对待测 的模板的模板DNA进行测序。进行测序。 第28页/共64页 第29页/共64页 第30页/共64页 第31页/共64页 GenomeAnalyzer系统需要的系统需要的样品量低至样品量低至 100ng，文库构建过程

11、简单，减少了样品分离，文库构建过程简单，减少了样品分离 和制备的时间，配对末端读长可达到和制备的时间，配对末端读长可达到250bp， 每次运行后可获得超过每次运行后可获得超过20 GB的高质量过滤数的高质量过滤数 据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代 测序技术。测序技术。 第32页/共64页 SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理通过连接反应进行测序。其基本原理 是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成， 取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括： 文库准备文库准

12、备 扩增扩增 微珠与玻片连接微珠与玻片连接 连接测序连接测序 第33页/共64页 第34页/共64页 第35页/共64页 第36页/共64页 超高通量超高通量是是SOLID系统最突出的特系统最突出的特 点，目前点，目前SOLID 3单次运行可产生单次运行可产生50 GB 的序列数据，相当于的序列数据，相当于17倍人类基因组覆倍人类基因组覆 盖度。盖度。 第37页/共64页 第38页/共64页 第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发 展和应用展和应用, , 但是由于其但是由于其测序速度、成本、准确度测序速度、成本、准确度等等 关键问题的解决仍存在困难关键

13、问题的解决仍存在困难, ,研究者们很快将目光研究者们很快将目光 转向了更高更新的测序解决方案。转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也单分子测序也 就应运而生。就应运而生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因组研究所与浪潮成立中科院北京基因组研究所与浪潮成立 “中科院北京基因组研究所中科院北京基因组研究所浪潮基因组科学联合浪潮基因组科学联合 实验室实验室” 第39页/共64页 三代测序技术是以三代测序技术是以单分子测序单分子测序为特点的测序技术为特点的测序技术 v 单分子即时单分子即时DNA测测序技术序技术( (SMRT) ) v HeliScope单分子测序单分子测序

14、v 基于荧光共振能量转移的即时基于荧光共振能量转移的即时DNA测序测序 v 纳米孔单分子测序技术纳米孔单分子测序技术 第40页/共64页 第三代测序技术第三代测序技术 1 1、目前一期的读取速度为目前一期的读取速度为3bp/ s3bp/ s 2 2、它实现了、它实现了DNADNA聚合酶内在自身的聚合酶内在自身的processivity （延续性，也就是（延续性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很聚合酶一次可以合成很 长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 3 3、它的精度非常高，达到、它的精度非常高，达到99.9999%99.9999%。 第4

15、1页/共64页 标记荧光基因标记荧光基因 DNA聚合酶作用 显微镜下进行荧光探测显微镜下进行荧光探测 零级波导的纳米结构零级波导的纳米结构来实来实 现即时观察和背景荧光干现即时观察和背景荧光干 扰扰 第42页/共64页 D N A 聚 合 酶 第43页/共64页 优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记 录到录到单个碱基单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCRPCR扩增出数千个拷贝扩增出数千个拷贝 以增加信号亮度的缺陷。以增加信号亮度的缺陷。 DNADNA 聚聚 合合

16、酶酶 荧光标荧光标 记的记的 dNTPdNTP 产生荧光产生荧光 CCD记录记录 发生了碱基延伸反应发生了碱基延伸反应 平面基板模拟图平面基板模拟图 第44页/共64页 能量 第45页/共64页 DNADNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔, , 利用核酸外切酶的特性来识别出不同的利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNADNA碱基碱基 优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNADNA进行标记进行标记 ，也就省去了昂贵的荧光试剂和，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCDCCD照相机。照相机。 内部：核酸外切酶和环式糊精

17、 由生物分子组成的纳米孔由生物分子组成的纳米孔 第46页/共64页 第47页/共64页 第48页/共64页 第49页/共64页 第50页/共64页 完成全基因组测序的部分的物种完成全基因组测序的部分的物种 第51页/共64页 第52页/共64页 第53页/共64页 转录组测序的研究对象为特定细胞在某转录组测序的研究对象为特定细胞在某 一功能状态下所能转录出来的所有一功能状态下所能转录出来的所有RNARNA的总的总 和，包括和，包括mRNAmRNA和非编码和非编码RNARNA。转录组测序是。转录组测序是 指用新一代高通量测序技术对物种或者组织指用新一代高通量测序技术对物种或者组织 的转录本进行测序并得到相关的转录本信息的转录本进行测序并得到相关的转录本信息 。 第54页/共64页 第55页/共64页 第56页/共64页 第57页/共64页 第58页/共64页 第59页/共64页 第60页/共64页 利用光学成像技术设计的新型利用光学成像技术设计的新型DNADNA测序简图测序简图 第61页/共64页 原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近，原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近， 离成像面越