任务三发酵罐实消接种.doc

1、任务三：发酵罐实消、接种子任务二；发酵罐接种引导课文通过本任务的学习你应该能够掌握下列知识：1掌握小型发酵罐无菌接种的原理和方法。2理解杂菌污染的途径和防治方法。3. 掌握接种安全操作规程通过操作训练你应该具有下列能力：1. 能进行发酵罐无菌接种操作。2对接种异常问题能及时预见、反应、处理。3. 能严格按照安全操作规程进行操作。前面我们已经制备了符合要求的产黄青霉菌种子，进行了发酵罐的清洗及空消、实消，接下来的任务就是进行接种了，那么发酵罐接种的知识你了解多少呢？一、无菌接种的必要性：案例：山东省某大型制药企业的 2 号发酵生产车间连续发生染菌污染事件， 且每次杂菌的种类基本相同，分析可能染菌

2、的原因，提出检查方案和防治措施。分析：若排除了管路灭菌、空消、实消不彻底而导致染菌的因素外，能导致污染的另外一个原因就是接种操作不规范引起的。我们的发酵属于纯培养，是由单一菌种接种以后进行的培养，其中不可以有任何杂菌，否则会影响产品的使用效果，所以为了确保每一批发酵的成功，在上罐之前，发酵人员必须具备以下两种意识：无菌意识安全意识二、接种量的确定接种量指移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或过小，均会影响发酵。接种量过大会引起

3、溶氧不足，影响产物合成；而却会过多移入代谢废物；接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。通常接种量：细菌1-5%，酵母菌 5-10%，霉菌 7-15%，有时 20-25%。二、发酵罐接种的方法一般情况下， 发酵罐接种有三种方法： 火圈直接倒种注射器接种压力差接种。前两种方法适用于小型发酵罐，第三种方法适用于大型工业化生产发酵罐。1、火圈直接倒种法操作规程如下：当发酵液温度降到接种温度时即可进行接种。准备合格的摇床菌种。用酒精棉擦洗罐顶接种口，并在接种口四周围上酒精棉。接种者的双手也需用酒精棉擦洗消毒、晾干。调进气阀，减少进气量（不能关闭，否则罐压跌零，引起污染） ，拧松接种口螺母；检查罐

4、内压力是否在 0.01MPa 以下（如不在应开大排气阀或调进气阀，减少进气量） ，点燃接种口四周的酒精棉；拧下接种口螺母，并将其放入预先准备的盛有酒精的培养皿中。将菌种瓶的瓶口在火焰上烧一会儿，并在火焰下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。盖上接种口螺母，灭火焰，拧紧螺母；并用酒精棉将接种口擦洗干净。调节进气阀及排气阀，达到工艺要求的通气量及保持罐压。图示：火圈直接倒种法2、注射器接种法：灭菌及罐压调节都同于火圈直接倒种法。此时准备无菌注射器，预先在超净台上将菌种液体吸入注射器内，无菌操作将菌种注射入发酵罐内。此种方法尤其适合于微小型发酵罐（容积在 5L ）以下。3、压力差接种：移种前应先路内的

5、冷凝水随时可以排空。移种时在关闭蒸汽阀后应当立即进行移种，避免造成负压污染。采用压差移种即 P 小大于 P 大，移种前对移种管道、阀门蒸汽灭菌20min， P小 0.05 Mpa， P 大 0.03Mpa，打开移种管道上的阀门，通过压差作用转罐，移种结束后立即关闭移种阀， 然后打开与之联通的蒸汽阀通入蒸汽进行冲刷消毒，并立即清洗种子罐，防止发酵料粘结在管道阀门及罐壁上，消毒后立即关闭蒸汽阀门和排冷凝水的阀门及管帽。三、我们实验室发酵罐接种操作及注意事项注意事项：1. 环境：关闭车间门窗和排气扇，接种环境周围禁止人员来回走动，降低空气流动性；2. 无菌：倒摇瓶需靠在火焰附近，三角瓶不可倾斜过度，

6、避免种子液流出；接种操作过程中罐压不能掉零；3. 安全：三角瓶靠近火焰倾倒，但需注意操作人员应离开火焰一段距离，穿好防护服，严禁穿羽绒服、尼龙等易燃衣物；女生不可披头发、带丝巾操作；点燃火焰圈不可随处乱扔，熄灭以后才可以继续操作。准备操作? 准备好接种所需材料? 关闭门窗、排气扇? 操作人员合理分工，一个为主操作，一个为副操作消毒? 副操作用酒精棉擦拭接种口进行消毒? 消毒以后用火焰保护好接种口接种1. 本系统采用火焰封口接种，接种前应事先准备：酒精棉花、钳子、镊子、接种环、石棉网手套、 Z 字扳手。2. 菌种装入三角烧瓶内，接种量根据工艺要求确定。3. 将酒精棉花围在接种环周围点燃，将菌种瓶

7、口在火焰上烧一会儿，用 Z 字扳手拧开接种口，迅速将菌种倒入罐内，此时应向罐内通气，使接种口有空气排出（压力接近与零，但不能为零） 。4. 将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧。接种后，罐压保持在 0.03-0.07Mpa （0.05Mpa），调节通风量。消毒? 副操作用酒精棉擦拭接种口消毒以后迅速盖上接种盖， 设置好参数后进行培养小贴士：操作发酵罐，必备无菌意识和安全意识，这并非纸上谈兵，如果您不具备这两种操作素质，那发酵罐可能是失败试验场或是定时炸弹，那么，需从哪些方面注意呢？无菌意识：由于微生物个体小、分布广泛等特性，发酵染菌的途径有很多，而且如果染菌的话，我们无法及时做出判断，必须培养一段时间才能看出来，发现以后的结果只能是倒罐，造成不小的损失，所以操作之前必须具备无菌意识，每一步操作都按照操作规程进行，抓住每一个细节，才能确保不会染菌。安全意识空气压力能达到0.250.3MPa ；蒸汽压力能达到0.25MPa ，温度能达到139；设备用电；机械搅拌；酸碱腐蚀。你了解这些数据吗？任务工单任务：阅读完引导文后，请结合网络资料查阅设计我们实验室小型发酵罐的接种方案，内容至少包括：接种准备（药品、器具、发酵罐压力调试）、接种量确定、接种操作（