2020年糖精钠的检测精编版.doc

1、精选文档苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2003，糖精钠的检测参照GB/T5009.28-2003，即可开展实验。苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度， 许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、 山梨酸为着重点， 从样品前处理、 检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。2 样品前处理的注意事项GB/T5009.28-2003和 GB/T5009.29-2003在文字结构上有缺陷， 在

2、涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。 这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。GB/T5009.29-2003使用 5 硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。如用10钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10 亚铁氰化钾溶液和20 醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。精选文档精选

3、文档具体操作步骤如下：取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品5.0 克于 50ml 比色管中，加水20ml ，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0ml ，加入 9.5mL10% 亚铁氰化钾溶液，9.50mL20% 乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过 0.45m微孔滤膜 ,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL 测定。用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。3 检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。

4、原因如下：3.1 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。尤其对于高油脂样品 （如月饼） 若采用碱化排油酸化提取挥干溶解等步骤，再上气相色谱仪检测，工作量大，试剂毒性也大，且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。3.2 用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测，而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的检测。3.3 液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏，可进行更低含量的检测。如用二极管阵列检测器，还可辅助定性，这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。4 选用气相色谱仪时的注意事项GB/T5009.29所用的气相色谱柱为5 DEGS 1 磷酸固定液的60 80

5、 目 ChromosorbW AW ，。这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点，但同时也有稳定时间较长的缺点。精选文档精选文档该柱的适用的样品提取溶剂为石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，则溶剂峰拖尾效应较大，对山梨酸的测定有影响。如用毛细管柱， 能取得更好的峰形和灵敏度，但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱，0.530mm内径， 10 15m 长度。色谱条件可能需用程序升温。在气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸，后出苯甲酸。糖精钠不能直接用气相色谱进行检测，必须衍生化后才能汽化进样。5 选用液相色谱仪的注意事项按照 GB/T5009.29 ，流动相应为5 ： 95 的甲醇

6、： 0.02M 醋酸铵溶液，但是这个比例仅是个参考值，我们在工作中应根据实际情况进行调节。为什么用甲醇溶液？甲醇 有两个作用， （ 1）防腐 ，液相色谱柱最怕流动相长菌，尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性，有杀菌作用。（2）调节流动相极性，这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、 糖精钠的保留时间发生明显的改变，因此可以通过改变流动相中甲醇含量，以调节这几个组分的出峰和分离，以得到较理想的色谱图。5：95 是一个通用的比例，如减少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢 ，扩散效应增大， 峰形较差 ，但这三组分的分离情况较好 。如 增加甲醇含量 ，苯甲酸、山梨酸、糖精

7、钠的 出峰时间提前 ，扩散效应较小，峰形尖锐，但这三组分的分离情况可能受影响，产生重叠。在选择条件时，只能通过实验手段，如配制3： 97 ，4： 96，5：95， 6：96 ，7：93 的流动相，综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。不同柱的最适比例不同，举例来说，色谱科公司的液相柱最适比例为4： 96，而岛津公司液相柱的最佳比例为7：93 。就是同一根柱，一年前和一年后的极性也会有变化，需调节溶液配比。精选文档精选文档为什么使用0.02M醋酸铵溶液？加入醋酸铵 是为了 调节离子强度，使待测物的峰形不致于变坏。如果 单独检测苯甲酸和糖精钠，加不加醋酸铵没有什么关系 ，都可以得到较好的峰形；但

8、是 检测山梨酸 时流动相 一定要加醋酸铵，否则得不到一个完整的色谱峰，峰形呈破裂状。醋酸铵溶液浓度不需严格控制，0.01M 、 0.02M 、0.04M 均可。苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。在流动相 5： 95 及以下比例时，次序是苯甲酸、 山梨酸、 糖精钠（注意一下气相的出峰次序） ，逐步增大甲醇含量， 苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前，而糖精钠是出峰时间迅速提前，随着甲醇比例的逐步增大（ 1 5 30），原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、 山梨酸重叠， 并位于最前面，其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度，次序不变。用高甲醇比例条件（甲醇15 以上）做

9、出的三种标准物质色谱图峰形较好，出峰时间也较快，但 做实际样品时干扰较大；因此 建议尽量使用低甲醇比例条件（甲醇 5 左右）。6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断苯甲酸、山梨酸超标的样品较多，由于它们往往牵涉到一批货物是否合格，因此责任重大。由于该方法定量较准确，因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。如同时有气相色谱仪和液相色谱仪，建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照，如定量结果差不多，即可确认。如只有气相色谱仪，应利用其在填充柱保留时间稳定的特性，同时进五针标准液和五针样品液（注：峰面积应差不多，否则需对一方按比例稀释），如标准和样品液的保留时间相差时间超过 1 秒，可认为不是。（如进针的技

10、术不过关，请不要做此实验）如用液相色谱仪，当检测器为二极管阵列检测器时，根据保留时间和紫外吸收图结合定性，当只有紫外检测器时，改检测波长为220nm ， 230nm ， 250nm ，重复进标准和样品液，由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。精选文档精选文档如有微生物检测手段，可加样品于有菌培养基中，观察有无抑菌现象，如无抑菌现象则无防腐剂。不是很推荐用双柱法，因为有时柱极性相差不大，反而会影响最终判断。7 糖精钠超标时的判断当检测糖精钠超标时， 除了采用二极管阵列检测器或波长验证， 还可以利用糖精钠的荧光特性，用荧光检测器进行验证。荧光条件是激发波长为 277nm ，荧光波长为 410

11、nm 。只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多，才可以判断为是。还有一个简单粗糙、 却也行之有效的验证方法，即感官法。糖精钠是一种甜味剂，以感觉到它的甜味，如果含量超标，一定能尝出来。用舌头可8 标准溶液的配制贮存问题苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体，一般几个月后会严重降解，。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层，可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。在配制标准溶液时，初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠，用水溶解苯甲酸，晃了半天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾，用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。9 苯甲酸、山梨酸的应用范围首先应注意到， 并不是

12、所有食品都需要加入防腐剂，只有那些富含营养物质，且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要，否则对厂家来说会增加不必要的成本。酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完，月饼等需在货架上摆放，如不加防腐剂很快会发霉变质，有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕，即在细菌大量繁殖前己被消化了，因而没有添加的必要。精选文档精选文档苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm 的浓度，有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的，而不是厂家出于防腐目的加入的。苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会

13、添加苯甲酸、山梨酸，有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂，或自行规定需冷藏（如某些月饼）。因此有些食品检测不出也属正常。另外， 我们应该比较清楚地理解苯甲酸与苯甲酸钠、山梨酸与山梨酸钾之间的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、 山梨酸钾形式加入，它们不易汽化，易溶于水，但不溶于甲醇等有机试剂；而苯甲酸、山梨酸易汽化，易溶于有机试剂，但是几乎不溶于水。检测时要注意有机酸及其盐类之间的转换。GB/T16345-1996前言本标准非等效采用国外标准。本标准的附录A 是提示的附录。本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准负责起草单位：卫生部食品卫生监督检验所负责起草；参加起草单位：北京市卫生防疫站，中国

14、预防医学科学院环境卫生监测所。本标准主要起草人:杨祖英、张平伟、孙淳、姚孝元、郑兰波。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。中华人民共和国国家标准饮料中乙酰磺胺酸钾(安赛蜜 ) 的测定GB/T 16345-1996Deternination of Acesulfame K in Beverage- - -1 范围本标准规定了饮料中乙酰磺胺酸钾的测定方法。精选文档精选文档本标准适用于汽水、可乐型饮料、果汁、果茶等食品中乙酰磺胺酸钾的测定。也适用于糖精钠的测定。本法取样量为2.5g 时，最低检出限为乙酰磺胺酸钾、糖精钠各50mg/kg(L) 。2 原理样品中乙酰磺胺酸钾、

15、糖精钠经高效液相反相柱C18 分离后，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。3试剂有机溶剂需重蒸3.1甲醇 :分析纯3.2乙腈 :分析纯3.30.02mol/L 硫酸铵溶液 :称取硫酸铵2.642g，加水溶解至 1000mL 。3.4硫酸溶液 :10% 。3.5中性氧化铝 :层析用， 100 200 目。3.6乙酰磺胺酸钾，糖精钠标准储备液:精密称取乙酰磺胺酸钾、糖精钠各0.1000g，用移动相溶解后移入 100mL 容量瓶中，并用移动相稀释至刻度，即含乙酰磺胺酸钾、 糖精钠各 1mg/mL 的溶液。3.7乙酰磺胺酸钾、糖精钠标准使用液:吸取乙酰磺胺酸钾、糖精钠标准储备液2mL于 50mL 容量瓶

16、，加移动相至刻然后分别吸取此液1mL 、 2mL 、 3mL 、 4mL 、 5mL 于10mL 容量瓶中，各加移动相至刻度，即得各含乙酰磺胺酸钾，糖精钠0.004mg/mL 、0.008mg/mL 、 0.012mg/mL 、 0.016mg/mL 、 0.020mg/mL 的混合标准液系列。3.3移动相 :0.02M 硫酸铵 (740 800)+甲醇 (170 800)+ 甲醇 (170 150)+ 乙腈 (90 50)+10%H2SO4(1mL) 。4 仪器4.1高效液相色谱仪4.2超声清洗仪 (溶剂脱气用 )4.3离心机4.4抽滤瓶4.5G3 耐酸漏斗4.6微孔滤膜 0.45 m4.7

17、层析柱，用 10mL 注射器筒代替较好，内装3cm 高的中性氧化铝。5 分析步骤5.1样品处理5.1.1汽水 :将样品温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气。吸取样品2. 5mL 于 25mL容量瓶中。加移动相至刻度，摇匀后，溶液通过微孔滤膜过滤，滤液备作HPLC 分析用。5.1.2可乐型饮料 :将样品温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气，吸取已除去二氧化碳的样品 2.5mL ，通过中性氧化铝柱，待样品液流至柱表面时，用移动相洗脱，收集 25mL 洗脱液，摇匀后超声脱气，此液备作HPLC 分析用。5.1.3果茶、果汁类食品吸取 2.5mL 样品，加水约 20mL 混匀后，离心 15 分钟 (4000 转

18、 /分) ，上清液全部转入中性氧化铝柱，待水溶液流至柱表面时，用移动相洗脱。收集洗脱液25mL ，混匀后，超声脱气，此液作HPLC 分析用。5.2测定精选文档精选文档5.2.1HPLC 参考条件分析柱 :大连化物所生产的Spherisorb C18、 4.6150mm。粒度 5 m。移动相 :0.02M 硫酸铵 (740 800)+ 甲醇 (170 150)+乙腈 (90 50)+10%H2SO4(1mL) 。波长 :214m流速 :0.7mL/ 分5.2.2标准曲线 :分别进含乙酰磺胺酸钾、糖精钠0.004mg/mL 、 0.008mg/mL 、0.012mg/mL 、 0.016mg/mL

19、 、 0.020mg/mL 混合标准溶液各 10L ，进行 HPLC 分析，然后以峰面积为纵坐标，以乙酰磺胺酸钾、糖精钠的含量为横坐标，画标准曲线。5.2.3样品测定 :进 5.2 项下的样品处理后的样品溶液10 L ，测定其峰面积，从标准曲线查得测定液中乙酰磺胺酸钾、糖精钠的量。HPLC 色谱图见下 :见附图1乙酰磺胺酸钾；2糖精钠； 3咖啡因； 4天门冬酰苯丙氨酸甲酯6 结果6.1计算C 1000X=-V2m- 1000V1式中 :X 样品中乙酰磺胺酸钾、糖精钠的含量g/kg 或 g/L 。C由标准曲线上查得进样液中乙酰碘胺酸钾、糖精钠的量，mg/mL 。V1 样品稀释液总体积、mL 。V

20、2 HPLC 测定进进样的体积，mL。m样品质量 ,g。6.2本标准检出限仪器检出限0.04 g；方法检出限:乙酰磺胺酸钾、糖精钠各0.004mg/mL(g) ，标准曲线范围乙酰磺胺酸钾、糖精钠各为0.004mg/mL 0.020mg/mL 。方法回收率为 88.0 105%，平均回收率为 92.12%、 SX=4.8 ，相对标准差 (R.S.D)=5.0% 。附录 A(提示的附录 )方法评价A1: 方法评价本标准规定了用高效液相测定饮料中乙酰磺胺酸钾、糖精钠，并能同时测定咖啡因、知门冬酰苯丙氨酸甲酯，且简化样品处理，国内外未见同时测定这四种物质的报导。A2方法验证A2.1柱层析洗脱液的研究样

21、品通过中性氧化铝小柱后，比较了水、移动相两种洗脱剂，结果表明精选文档精选文档水不能洗脱乙酰磺胺酸钾、糖精钠，而移动相能洗脱乙酰磺胺酸钾、糖精钠、咖啡因、天门冬酰苯丙氨酸甲酯。A2.2乙酰磺胺酸钾、糖精钠在中性氧化铝柱上流出曲线吸取 100mg/L 的加标乙酰磺胺酸钾、糖精钠的可乐，M( 过已用少量水润湿的中性氧化铝小柱，然后以流动相洗脱，连续收集7 管，每管 5mL ，用 HPLC 测定每管中乙酰磺胺酸钾、糖精钠量。结果表明，从第4 管起均未检出乙酰磺胺酸钾、糖精钠。A2.3HPLC 移动相的研究本标准研究了醋酸铵缓冲液+甲醇、醋酸铵缓冲液+异丙醇系统，硫酸铵缓冲液 +甲醇系统，试验结果表明硫酸铵缓冲液+甲醇系统能分离乙酰磺胺酸钾、糖精钠、咖啡因、天门冬酰苯丙氨酸甲酯。见图及表。移动相试验表移动相Rt乙酰磺糖精钠咖啡因天门冬酰苯氨酸钾丙氨酸甲酯0.02m 硫酸胺 +甲醇 +10%硫酸 3.0103.6379.00210.870(1)700+300+1 2.8703.47911.19713.582(2)720+280+l 3.2924.62213.96016.320(3)750+250+10.02