基因研究方法课件

1、基因研究方法课件 分子细胞生物学研究方法分子细胞生物学研究方法 (一一)功能基因的筛选方法功能基因的筛选方法 基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法: 1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选 2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选 3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位 4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究 基因研究方法课件 对

2、表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选 一、文献查阅一、文献查阅 基因研究方法课件 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选 一、文献查阅一、文献查阅 二、充分利用二、充分利用GeneBank、SymAtlas(/SymAtlas/)、 ZFIN等网上公共资源等网上公共资源 a. 直接查阅基因表达信息直接查阅基因表达信息 基因研究方法课件 Mouse jumonji Human RAN binding protein 1 基因研究方法课件 NCI_CGAP_Zki

3、d1: adult kidney NIH_ZGC_8: Liver NIH_ZGC_26: ovary, 1 year old female NIH_ZGC_21: skin, normal adult NIH_ZGC_6: testis NIH_ZGC_27: whole body, 30dpf NIH_ZGC_29: 30dpf, whole body, probable males Sgano SJD adult male: whole body, adult male NIH_ZGC_28: whole body, female 基因研究方法课件 De Ruijter AJ et al

4、. 2003. Biochem. J. 370: 737-749. (review) HDAC expression in various normal and cancerous cells 基因研究方法课件 E11.5 E14.5 HDAC2 highly expresses in heart region during embryonic development E12.5 15.5 17.5 P 3 15 25 65 -HDAC2 -tubulin HDAC2 expression levels in heart Yin Z et al. (2007). Nat. Med. 13, 3

5、24-331. 基因研究方法课件 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因对表达于特定组织、特定阶段的功能基因 的筛选的筛选 一、文献查阅一、文献查阅 二、充分利用二、充分利用GeneBank、SymAtlas(/SymAtlas/)、 ZFIN等网上公共资源等网上公共资源 a. 直接查阅基因表达信息直接查阅基因表达信息 b. 对大量的对大量的est资源进行利用和分析资源进行利用和分析: 如熟知斑马鱼的一些被大量阅码的常用如熟知斑马鱼的一些被大量阅码的常用cDNA文库：文库： NIH_ZGC_4: brain NIH_ZGC_15: embryo, 2-

6、8hpf NIH_ZGC_18: embryo, 18-20hpf NCI_CGAP_Zemb2: embryo, 24hpf GISZF001: embryo, 0-72hpf NCI_CGAP_Zemb3: embryo, 72hpf Zebrafish adult retina cDNA: adult eye, retina 1-2 year old NIH_ZGC_9: eye, 72hpf NIH_ZGC_22: Gill NIH_ZGC_17: adult heart 基因研究方法课件 鱼类研究的遗传资源鱼类研究的遗传资源 Cossins A and Crawford DL. 20

7、05. Nat. Rev. in Genetics, 6, 324-333. 基因研究方法课件 一、文献查阅一、文献查阅 二、充分利用网上公共资源二、充分利用网上公共资源 三、对组织细胞特定过程中差异表达基因的筛选三、对组织细胞特定过程中差异表达基因的筛选 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因对表达于特定组织、特定阶段的功能基因 的筛选的筛选 基因研究方法课件 Mehta D. et al., 2010. Curr. Psychiatry Rep. 12, 135-144. 基因表达的研究方法基因表达的研究方法 基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 Yin Z, Kwang J

8、 & Sin YM. Carp interleukin-1 beta in the role of an immuno-adjuvant FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY 10 (4): 375-378 MAY 2000 Con A treatmentcontrol Driver cDNA Test cDNA cDNA subtraction cloning Induced cDNA List: Interleukin-1 Janus kinase-2 Transforming growth factor-1 Heat shock protein 70 Heat shoc

9、k protein 90 Elongation factor-1 Bleomycin hydrolase Cytochrome c oxidase subunit II Cytochrome C oxidase subunit III Novel ests Percoll 基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Using DNA microarrays to monitor the expression of thousands of genes simultaneou

10、sly 基因研究方法课件 Using cluster analysis to identify sets of genes that are coordinately regulated 基因研究方法课件 4 . Selected Condition Tree:4 Sample Exp (Default Interpretation) Colored by:4 Sample Exp (Default Interpretation) Gene List:P in 2 of 4 (20210) 4 Sample Exp (. HDAC2 transcripts were 45 fold down

11、regulated in 2 sets of HDAC2-/- ventricle samples WT1WT2null2null1 基因研究方法课件 TABLE 2. Comparison of some gene expression levels in HDAC2 null heart with microarray analysis GeneFold difference of expression compared with WT Cell cycle, proliferation, meiosis, coenzyme metabolism Cell division cycle 2

12、0 homolog3.7 Stromal antigen7.6 Rec8-like 17.4 SMC-like 14.8 Polymerase, epsilon 2 (p59 subunit)8.1 Cyclin C9.2 Telomerase reverse transcriptase9.5 Cell division cycle 37 homolog5.6 Muscle development, contraction Troponin T3-26.3 Myosin light chain-24.3 ATPase, Ca+ transporting, cardiac muscle, fas

13、t twitch 1-7.8 Myosin, heavy polypeptide 6, cardiac muscle, alpha-6.5 Tropomyosin 2, beta-6.3 myogenin-7.6 Actinin alpha 3-.7.2 myozenin-3.2 基因研究方法课件 Identified Pathway (DAVIS): NFAT and Hypertrophy of the heart (Transcription in the broken heart)(Mus musculus) suppressed in HDAC2 null Myocyte enhan

14、cer factor 2C (MEF2c) Gata binding protein 4 (Gata 4) Thymoma viral proto-oncogene 1 (Akt) Calmodulin 1 Alpha-actin, skeleton muscle (-actin) 基因研究方法课件 Cossins A and Crawford DL. 2005. Nat. Rev. in Genetics, 6, 324-333. 基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法: 1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能

15、基因的筛选 2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选 3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位 4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究 基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析 一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究 Double muscle cattle Myostatin mutant Splotch mice 基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对

16、基因突变的个体的获取及分析 一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究 二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的产生 基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析 一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究 二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的产生 1。物理诱变。物理诱变 （如放射线、紫外线照射）（如放射线、紫外线照射） 2。化学诱变剂。化学诱变剂 （如（如ENU， N-ethyl-N-nitrosourea) 基因研究方法课件 基因研究方法课件 Generation of mutan

17、ts with developmental defects in zebrafish by ENU mutagenesis Peng J. et al. (2004). Chinese Sci. Bullet. 49: 2154-2158. 3.0 mM ENU Treatment 35 muatnt lines/320 F2 families 基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析 一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究 二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的

18、产生 1。物理诱变。物理诱变 （如放射线、紫外线照射）（如放射线、紫外线照射） 2。化学诱变剂。化学诱变剂 （如（如ENU， N-ethyl-N-nitrosourea) DNA插入插入 a. DNA片段插入片段插入 b. 病毒插入病毒插入 c. 转座子插入转座子插入 基因研究方法课件 Gene trapping b bgeo reporter SA ATG pA Insertional mutations Accessible to molecular analysis Tag gene for expression analysis Efficient: single transfecti

19、on gives 100s of mutations But, random insertions lack precision & intronic location 基因研究方法课件 Identification of trapped genes by 5 RACE AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Exon 1 geo trap RNA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA geo primer 1 Prime cDNA with Reverse Transcriptase 53 Enzymatically add tag sequence to cDNA 3 end cDN

20、A 533 PCR amplify with primers to tag sequence and geo Clone and sequence to identify Gene X Gene X geo primer 2 基因研究方法课件 Whole Genome Mutagenesis: Advantages of gene traps: Pre-existing commercial collections Trap often creates hypomorphic or null allele 3)Can use RT-PCR to screen for gene disrupti

21、on 4) -Geo servers as histological or enzymatic assay of target gene expression 基因研究方法课件 International Gene Trap Consortium Resource Tags in dbGSS Ensembl genes Genome coverage BG9,7753,19421% SIGTR7,3542,33016% GGTC9,8282,15915% ESDB5,5009887% FHCRC1,6277174% CMHD4,0235923% Total38,1075,72436% http

22、:/.uk Mutations available for 36% of genes 基因研究方法课件 Tol2Tol2转座子介导的基因增效基因诱捕技术转座子介导的基因增效基因诱捕技术 Kawakami K. 2005. Dev. Dyn. 234: 244-254. Parinov S. et al. 2004. Dev. Dyn. 231: 449-459. 基因研究方法课件 建立建立Tol2转座子增效基因诱捕的转基因斑马鱼诱变品系库转座子增效基因诱捕的转基因斑马鱼诱变品系库 突变品系的筛选工作：突变品系的筛选工作：已注射近已注射近400400粒斑马鱼受精卵，目前筛

23、选成功率为粒斑马鱼受精卵，目前筛选成功率为2/20,2/20, 尚有近尚有近200200尾有待筛选检查尾有待筛选检查 F0 30hpf F1 5dpf 基因研究方法课件 Screening for temperature-sensitive bacterial or yeast mutants 基因研究方法课件 Screens can detect mutations that affect an animals behavior 基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法: 1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能基

24、因的筛选 2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选 3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位 4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码

25、蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基 因表达的抑制）因表达的抑制） 相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找 与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究） 改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： a. 文献查阅文献查阅 基因研究方法课件 基因功能的体外

26、和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 a. 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因研究方法课件 Results of a BLAST search Sequence similarity can be provide clues about protein function 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） a. 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的

27、功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因研究方法课件 Domain information for zebrafish gasp Protease inhibitor domain DEAD domain: RNA binding KRXXKRKR etc: nuclear localizatin signal Zinc finger domain: DNA binding Homeodomain: DNA binding : Secretary signal peptide analysis Many domain analysis software on the web! 基因研

28、究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 1。细胞、组织染色（。细胞、组织染色（Ab免疫染色）免疫染色） 2。融合蛋白技术部（应用于蛋白定位、蛋白纯化提取）。融合蛋白技术部（应用于蛋白定位、蛋白纯化提取） 基因研究方法课件 Fusion p

29、roteins can be used to analyze protein function and to track proteins in living cells (1) Epitope tagging allows the localization or purification of proteins 基因研究方法课件 Fusion proteins can be used to analyze protein function and to track proteins in living cells (2) Fluorescence resonance energy trans

30、fer (FRET). 基因研究方法课件 Three types of matrices used for chromatography 基因研究方法课件 Purification of protein complexes using a GST-tagged fusion protein 基因研究方法课件 Popular Epitope tagging for fusion protein studies: GST (glutathione S-transferase, 25kDa) FLAG (“DYKDDDDK”, synthesized) HIS (“HHHHHH”, synthesi

31、zed) C-MYC (“EQKLISEEDL”, part of c-myc, synthesized) HA (“YPYDVPDYA”, part of hemagglatin, synthesized) VSV-G (“YTDIEMNRLGK”, synthesized) HSV(“QPELAPEDPED”, synthesized) V5 (“GKPIPNPLLGLDST”, synthesized) GFP ( about 235aa, 47kDa) 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因

32、的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基 因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验） 蛋白结合功能区蛋白调控功能区 pSV40，or

33、 pCMV, or other specific promoter 蛋白结合功能区突变的蛋白调控功能区 pSV40，or pCMV, or other specific promoter Dominant negative form Wild-type form 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位

34、（胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基 因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验） 2）特定外界刺激反应条件）特定外界刺激反应条件 （激素或细胞因子、营养条件、分化状况、（激素或细胞因子、营养条件、分化状况、 物理化学刺激等）物理化学刺激等） 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文

35、献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基 因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验）

36、2）特定外界刺激反应条件）特定外界刺激反应条件 （激素或细胞因子、营养条件、分化状况、（激素或细胞因子、营养条件、分化状况、 物理化学刺激等）物理化学刺激等） 3）基因的）基因的mRNA的降解破坏的降解破坏 基因研究方法课件 RNAi Introduction RNAi = RNA interference The term used to describe the interference of RNA as a natural mechanism, and also as a scientific research tool. The silencing of gene expressio

37、n by double-stranded RNA molecules. 基因研究方法课件 RNAi Introduction Naturally RNAi acts as a gene defence mechanism. Its purpose is to silence types of RNA that are not normally produced by cells such as RNA viruses and rogue genetic elements. RNAi is a useful tool to find out the function of a gene. 基因研

38、究方法课件 RNAi Introduction Early days of molecular biology: Forward Genetics Analysis that starts with phenotype to determine the genotype. Trait Identification DNA Sequencing Mutation Identification Gene Function Modern times: Reverse Genetics Controlled manipulation of genes to determine phenotype. D

39、NA Sequencing Gene manipulation Gene Function (siRNA) 基因研究方法课件 siRNA Introduction siRNA are short dsRNA molecules - 21 nucleotide strands of RNA in a staggered duplex - 19 nucleotides double-stranded, with 2 base overhangs. 基因研究方法课件 siRNA is created when an enzyme known as Dicer cleaves dsRNA into t

40、he short duplexed structure known as siRNA. siRNA Introduction 基因研究方法课件 siRNA Introduction 基因研究方法课件 Mechanism for RNAi to knock down RNA product 基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法 一、体外方法：一、体外方法： 文献查阅文献查阅 基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较） 基因序列分析基因序列分析-2 （ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团） 基因编码蛋白的细胞内定位

41、基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性） 相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找 与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究） 改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察 基因研究方法课件 From Current Protocols Co-Immuno- precipitation (Co-IP) 基因研究方法课件 From Current Proto

42、cols GST pulldown 基因研究方法课件 Cellular localization of the C114 protein (1) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Cellular localization of the C114 protein (2) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Nucleotide binding analysis of the C114 protein Yin Z., et al. (2003).

43、JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (1) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (2) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (3) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits PKR activation (1) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits PKR activation (2) Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845. 基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits