沉淀分离技术最新PPT课件

1、沉淀分离技术最新 沉淀分离技术 沉淀分离技术最新 v沉淀（precipitation）：在溶液中加入沉淀剂 使溶质的溶解度降低，形成固相从溶液中析 出，从而达到分离的一种技术。 v优点：过程简单、成本低、原料易得、便于小规模 生产 v缺点：过滤困难、产品质量较低、需重新精制 沉淀分离技术最新 v盐析 v有机溶剂沉析 v等电点沉析 v有机聚合物沉析 v其他沉析技术 沉淀分离技术最新 一 盐析 v盐析 沉淀剂：采用盐，硫酸铵 操作范围：饱和度20- 100% 适用于：蛋白质的分离 沉淀分离技术最新 一、盐析 原理 v 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的 带相反电荷的离子基团结合，中和了

2、生物分子表面的电 荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分 子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时， 生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易 相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀 从溶液中析出。 v 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用 降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露 出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。 沉淀分离技术最新 影响盐析的因素（p95-96） （一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子 表面电荷，使生物分子水合作用增强，具 有促进溶解的作用，称盐溶现象。 当盐浓度达一定值后,盐浓度升高，生物

3、分子 溶解度不断降低,产生了盐析作用,不同的生 物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不 同。 沉淀分离技术最新 （二）生物分子种类 生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基 团与疏水基团不相同，不同生物分子产生盐析现 象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。 （三）生物分子浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的 影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分子 的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质溶 液，其浓度为2%3%比较合适。 沉淀分离技术最新 （四） pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶 液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望 某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液 的pH值

4、偏离该成分的等电点。 （五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。 沉淀分离技术最新 盐析的操作与应用 （一）盐析的操作 1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产 时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使 用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去 （如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。 2、加盐的方法 （1）直接加入固体硫酸铵法 （2）加入饱和硫酸铵溶液法 沉淀分离技术最新 3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸 铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固- 液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进 行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析

5、操作时加入盐的纯度、加量、加入 方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控 制。 沉淀分离技术最新 （4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共 沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般 低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常 用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使 蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长 的离心时间。 （5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、 凝胶过滤及超滤等。 沉淀分离技术最新 （二）盐析的主要应用 盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产 生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段 完全能达到很好的分离效果。 由于成本低，操作安全简单，对许多生物

6、活性物 质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、 多糖、核酸等物质的分离纯化。 沉淀分离技术最新 二、有机溶剂沉析 原理 （一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了 自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄， 导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质 的溶解度。 （二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机 溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶 质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸 引而聚集。 沉淀分离技术最新 影响有机溶剂沉析的因素 （一）温度 大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机 溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性， 且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机 溶剂必须

7、预先冷至较低温度，一般在0以下，操 作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢， 并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到 的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的 挥发。 沉淀分离技术最新 （二）生物样品的浓度 与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量 和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性， 但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之， 对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少 了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降。 一般认为，对于蛋白质溶液0.5%2%起始浓度 较合适,对于粘多糖以1%2%为起始浓度为宜。 沉淀分离技术最新 （三）pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳

8、定 的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低 的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析 的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在 等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避 免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的 发生。 沉淀分离技术最新 （四）离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小， 物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。 盐的浓度太大(0.10.2molL以上)，就需大量 的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有 机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度 时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解 度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既 能使沉析迅速形成，又能对蛋白质

9、或酶起一定 的保护作用，防止变性。 沉淀分离技术最新 （五）金属离子 在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某 些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、 Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形 成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不 影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机 溶剂的耗量，0.0050.02molL的Zn2+可使有 机溶剂用量减少l3至12,使用时要避免会与 这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根) 的存在。 沉淀分离技术最新 有机溶剂沉析的应用 （一）有机溶剂沉析的特点 优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其 他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内 沉析；

10、沉析不用脱盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起 变性失活，操作需在低温下进行。 沉淀分离技术最新 （二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和 核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择 合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、 pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉 析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一 步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有 机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除 有机溶剂，以免影响样品的生物活性 沉淀分离技术最新 三、等电点沉析 等电点沉析原理等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某 一生化物质的等电点

11、，使其从溶液中沉淀 析出而实现分离的技术称为等电点沉析技 术。 等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零 时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间 排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集 起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低 沉淀分离技术最新 等电点沉析的注意事项 （一）等电点的改变 （二）目的物的稳定性 （三）盐溶作用 （四）pH的调节 沉淀分离技术最新 等电点沉析的应用 （一）在生化产品的分离纯化过程中，常利用 两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸 等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离 纯化。 （二）等电点沉析只适用于水化程度不大，在 等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等 电点

12、(pH=5.4)附近,难溶于水，能产生沉析。 （三）等电点沉析对很多蛋白质不适合：目标蛋白质浓 度低只靠调节ph难以沉淀，同时在等电点时不稳定易变 性。 所以常与其他沉淀方法联用。如盐析常与其他沉淀方法联用。如盐析 沉淀分离技术最新 有机聚合物沉析 有机聚合物沉析原理有机聚合物沉析原理 利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而 析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 高聚物的分子量越高，沉淀效果越好，所需高 聚物的浓度越低：如PEG4000沉淀某蛋白的浓度是 0.25g/ml,而PEG2000是5% 优点： 沉淀分离技术最新 有机聚合物沉析 优点：工艺简单、所需高聚物的浓度低、 不会对产品质量产生影

13、响、一般没有 变性作用 缺点：高聚物成本高、难于回收。 主要用于实验室和处理价值高的蛋白质 分离 沉淀分离技术最新 有机聚合物沉析的应用 非离子型聚合物最早在20世纪60年代时被用来 沉析分离血纤维蛋白原、免疫球蛋白，和沉析 一些细菌与病毒，近年来广泛用于核酸和酶的 分离纯化。 沉淀分离技术最新 其他沉析技术 一、金属离子沉析 （一）许多生物活性物质（如蛋白质、核酸、多 肽、抗生素和有机酸等）能与金属离子形成难 溶性的复合物而沉析。 （二）金属离子沉析生物活性物质已有广泛的应 用，如锌盐可用于沉淀杆菌肽和胰岛素等， CaCO3用来沉析乳酸、枸橼酸、人血清蛋白 等。此外，该技术还能用来除去杂质。 沉淀分离技术最新 二、有机酸沉析 含氮有机酸如苦味酸和鞣酸等能够与有机分子的 碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 但这些