沉淀技术PPT课件

1、沉淀技术 沉淀技术沉淀技术 YOUR SUBTITLE GOES HERE 沉淀技术 生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程 原料液原料液 细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) ) 细胞胞内产物细胞胞内产物 路线一路线一路线二路线二 细胞破碎细胞破碎 碎片分离碎片分离 路线一路线一A A 路线一路线一B B 清液胞外产物清液胞外产物 粗分离粗分离( (沉淀沉淀/ /超过滤超过滤/ /萃取萃取) ) 纯化纯化( (层析、离子交换、吸附层析、离子交换、吸附) ) 脱盐脱盐( (凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤) ) 浓缩浓缩( (超滤超滤) ) 精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )

2、包含体包含体 溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) ) 复性复性 沉淀技术 沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解 度降低而形成无定形固体沉淀的过程。度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的：沉淀法的目的： (通过沉淀达到通过沉淀达到浓缩浓缩的目的；的目的； (沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉 淀所需成分，淀所需成分，初步纯化初步纯化 ； (将已纯化的产品由将已纯化的产品由液态变成固态液态变成固态，加以保存，加以保存 或进一步处理。或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，沉淀法是

3、最古老的分离和纯化生物物质的方法， 但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 沉淀技术 沉淀法的分类沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1 1）盐析法；）盐析法； （2 2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法； （3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法； （4 4）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法； （5 5）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法； （6 6）复合盐沉淀法等）复合盐沉淀法等 （7 7）亲和沉淀法）亲和沉淀法 （8 8）选择性沉淀法。）选择性沉淀法。 沉淀技术 蛋白质表面性质蛋白

4、质表面性质 P49P49 蛋白质是蛋白质是两性两性高分子电解质（高分子电解质（amphoteric amphoteric polymerpolymer），主要由疏水性各不相同的），主要由疏水性各不相同的 20 20 种氨种氨 基酸组成。基酸组成。 在水溶液中，多肽链中的在水溶液中，多肽链中的疏水性疏水性氨基酸残基具氨基酸残基具 有有向内部折叠向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部的趋势，即便如此，一般仍有部 分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水 区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大， 疏水性强。疏水性强。

5、 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构 的外表面。的外表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形 成荷电区、亲水区和疏水区构成。成荷电区、亲水区和疏水区构成。 沉淀技术 沉淀技术 蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周 围溶液性质所决定。围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大 部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子

6、蛋白质比起在化学上类似的一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的 大分子蛋白质更易溶解。大分子蛋白质更易溶解。 沉淀技术 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 P50P50 u蛋白质周围的水化层蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)， 使蛋白使蛋白 质形成稳定的胶体溶液。质形成稳定的胶体溶液。 u蛋白质蛋白质分子间静电排斥作用。分子间静电排斥作用。 （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电 的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自 身基团的电离。蛋白质表面的

7、电荷与溶液中反身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。离子的电荷构成双电层。 沉淀技术 沉淀技术 盐析盐析 P51P51 盐析是可逆的，而变性是不可逆的盐析是可逆的，而变性是不可逆的 早在早在18591859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分年，中性盐盐析法就被用于从血液中分 离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离 和分级中使用，得到了比较满意的结果。和分级中使用，得到了比较满意的结果。 沉淀技术 盐析法机理盐析法机理 P51P51 （1 1）破坏）破坏水化膜水化膜，分子间易碰撞聚集，分子间易碰撞聚集， 将大量将大量 盐加到

8、蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的 水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃 至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2 2）破坏水化膜，暴露出）破坏水化膜，暴露出憎水区域憎水区域，由于憎水区，由于憎水区 域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多， 越易沉淀。越易沉淀。 （3 3）中和电荷中和电荷，减少静电斥力，减少静电斥力， 中性盐加入蛋中性盐加入蛋 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被

9、中和，静电 斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子 之间聚集而沉淀。之间聚集而沉淀。 沉淀技术 沉淀技术 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以 下两种情况：下两种情况： （1 1）“盐溶盐溶”现象现象(salt-in)(salt-in)低盐浓度下，增低盐浓度下，增 加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增 大大 。 （2 2）“盐析盐析”现象现象(salt-out)(salt-out)高盐浓度下，高盐浓度下， 中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下中和电荷、破坏水化膜，蛋

10、白质溶解度随之下 降降 。 沉淀技术 沉淀技术 l盐析作用要强盐析作用要强 l盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度 l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的 l来源丰富、经济来源丰富、经济 盐析用盐的选择盐析用盐的选择 P52 沉淀技术 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的 影响有一定差异，一般的规律为：影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价半径小的高价 离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较 弱弱 阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ： 柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4

11、42- 2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- - SCNSCN- - 阳离子盐析效果：阳离子盐析效果： NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子 沉淀技术 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、 磷酸钠磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 u（1 1） 价廉价廉 ； u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析 出来；出来； u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也

12、比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。 缺点：缺点： （1）水解变酸；）水解变酸； （2）高）高pH 释氨，腐蚀；释氨，腐蚀； （3）残留产品有影响。）残留产品有影响。 沉淀技术 盐析操作盐析操作( (加盐方式）加盐方式）P53P53 硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法： 1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体用于要求饱和度较高而不增大溶液体 积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快， 应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和

13、防止局部浓应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓 度过高；度过高； 2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体用于要求饱和度不高而原来溶液体 积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料 液会被稀释。液会被稀释。 3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸 入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到 设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度

14、 变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结 晶。晶。 沉淀技术 S=- S=-s s S S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L; g/L; I I离子强度，离子强度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子离子 i i的摩尔浓度；的摩尔浓度； ZiZi所带电荷所带电荷 常数，图中常数，图中截距截距 KsKs盐析常数，图中直线盐析常数，图中直线斜率斜率 CohnCohn经验式经验式 P52P52 蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系 沉淀技术 和和Ks的物理意义：的物理意义： 代表截距，即当离

15、子强度为零，也就是代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中纯水中 的假想溶解度的对数的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、。与蛋白质种类、温度、pHpH 值有关，与盐无关值有关，与盐无关 KsKs盐析常数，代表图中直线的盐析常数，代表图中直线的斜率斜率 从一些实验结果表明，从一些实验结果表明，KsKs与温度和与温度和pHpH无关，但和蛋白无关，但和蛋白 质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如 以硫酸铵作为沉淀剂时，以硫酸铵作为沉淀剂时，KsKs值对不同的蛋白质来值对不同的蛋白质来 说，其变化不会超过说，其变化不会超过1 1倍。倍。 沉淀技术 用盐

16、析法分离蛋白质的二种方用盐析法分离蛋白质的二种方 法法 第一类叫第一类叫KsKs分段盐析法，分段盐析法，在一定在一定PHPH和温度下通和温度下通 过改变离子强度实现，（固定过改变离子强度实现，（固定pH, pH, 温度，温度，改变改变 盐浓度盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常），由于蛋白质对离子强度的变化非常 敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液 第二种叫第二种叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下通在一定离子强度下通 过改变过改变PHPH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改改 变变pHpH及温度及温度），由于溶质

17、溶解度变化缓慢，且），由于溶质溶解度变化缓慢，且 变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一 步分离纯化和结晶。步分离纯化和结晶。 沉淀技术 u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶 解度越低。解度越低。 u在进行分离的时候，一般从低离子强度在进行分离的时候，一般从低离子强度 到高离子强度顺次进行。到高离子强度顺次进行。 u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷 冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性 盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐

18、析 出来。出来。 u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀 所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性 越大，也越易沉淀。越大，也越易沉淀。 影响盐析的因素影响盐析的因素 沉淀技术 盐析的影响因素：盐析的影响因素：pHpH值值 u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大， 净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶 解度最小。解度最小。 u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液PHPH值调到目的蛋白值调到目的蛋白 的等电点处。的等电点处。 u注意在水

19、中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐 浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况 调整溶液调整溶液PHPH值，以达到最好的盐析效果。值，以达到最好的盐析效果。 沉淀技术 盐析影响因素：温度的影响盐析影响因素：温度的影响 u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白 质溶解度在一定范围内随温度质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。增加而增加。 u但在高浓度下，蛋白质、酶和但在高浓度下，蛋白质、酶和 多肽类物质的溶解度随温度上多肽类物质的溶解度随温度上 升而下降。升而下降。 u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况

20、下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在感的酶要求在0-40-4进行。进行。 u随温度升高减小，热促失水随温度升高减小，热促失水 膜膜 uKsKs不随温度而变不随温度而变 沉淀技术 盐析的影响因素：蛋白质浓度盐析的影响因素：蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度 有关。有关。 Z高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高， 会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。会

21、发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀 作用比较少，但回收率会降低。作用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。因此需要在两者之间进行适当选择。 Z分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加 一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 Z一般认为一般认为2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 25 mg/mLmg/mL30mg

22、/mL30mg/mL。 沉淀技术 盐析注意事盐析注意事 项项 (选择适宜饱和度选择适宜饱和度 (采用分步盐析采用分步盐析 (盐析的成败决定于溶液的盐析的成败决定于溶液的pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pH pH 用用 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 (在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来 速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应 该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过 高，导致酶失活。高，导致酶失活。 (盐析后最好缓慢搅拌一个小时而

23、且再在冰浴中放置一盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一 段时间。段时间。 (为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 (盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析 较慢，一般可用超滤较慢，一般可用超滤 沉淀技术 盐析注意事项盐析注意事项 硫酸铵的使用：硫酸铵的使用： 硫酸铵中常含有少量的硫酸铵中常含有少量的重金属离子重金属离子，对蛋白质，对蛋白质 巯基有敏感作用，使用前用巯基有敏感作用，使用前用H H2 2S S处理处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性酸性（

24、PH=5.0PH=5.0左左 右），使用前需要用氨水调节至所需右），使用前需要用氨水调节至所需PHPH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸 铵加入后体积变大铵加入后体积变大 盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全 后才过滤或离心。后才过滤或离心。 过滤多用于高浓度硫酸铵溶液过滤多用于高浓度硫酸铵溶液 离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。 沉淀技术 盐析法特点：盐析法特点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。操作简单、安全。 不会引起蛋白质

25、变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。 沉淀技术 等电点沉淀法等电点沉淀法 isoelectric point 沉淀技术 等电点沉淀法等电点沉淀法 在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调 pH至等电点，使蛋白质至等电点，使蛋白质 所带净电荷为零，降低所带净电荷为零，降低 了静电斥力，而疏水力了静电斥力，而疏水力 能使分子间相互吸引，能使分子间相互吸引， 形成沉淀的操作称

26、为形成沉淀的操作称为等等 电点沉淀电点沉淀 不同的两性电解质具有不同的两性电解质具有 不同的等电点，以此为不同的等电点，以此为 基础可进行分离。基础可进行分离。 生产胰岛素时，在粗提生产胰岛素时，在粗提 液中先调液中先调PH8.0去除碱性去除碱性 蛋白质，再调蛋白质，再调PH3.0去除去除 酸性蛋白质。酸性蛋白质。 pH=pI 沉淀技术 图图16-10表示大豆蛋白的溶解度随表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。的变化情况。 等电点沉淀法等电点沉淀法 沉淀技术 等电点沉淀法注意事项等电点沉淀法注意事项 F本法适用于本法适用于憎水性憎水性较强的蛋白质，例如酪较强的蛋白质，例如酪 蛋白在等电点时能形

27、成粗大的凝聚物。蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。 F但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则 在低离子强度的溶液中，调在低离子强度的溶液中，调 pHpH在等电点并在等电点并 不产生沉淀。不产生沉淀。 F在调节等电点时，如果采用盐在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧酸、氢氧 化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或 蛋白变性。为了使蛋白变性。为了使pHpH缓慢变动，也可用乙缓慢变动，也可用乙 酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 F中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移 动

28、，同时最低溶解度会有所增大。动，同时最低溶解度会有所增大。 沉淀技术 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 organic sovent precipitation 沉淀技术 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖 和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早 使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。 优点优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白阿质）分辨能力比盐析法高，即蛋白阿质 等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2） 沉淀不用脱盐，过滤较为容易；沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点缺点

29、:1）对具有生物活性的大分子容易引起变）对具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，性失活，2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3）成本）成本 高高 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如 盐析法普遍。盐析法普遍。 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 沉淀技术 有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理 *A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D水）水） ， 减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质 分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、

30、核酸 等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉 淀。淀。 *B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，由于使用的有机溶剂与水互溶， 它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化 层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分 子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白 质沉淀。质沉淀。 *C 相反力：相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结 合形成疏水层合形成疏水层 沉淀技术 有机溶剂沉

31、淀法机理有机溶剂沉淀法机理 降低介电常数 破坏水化膜 沉淀技术 常用的有机溶剂沉析剂常用的有机溶剂沉析剂 选择依据：选择依据： 水溶性要好水溶性要好 介电常数要小介电常数要小 致变性作用要小（甲醇）致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中 容易获取容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、 糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用 的沉淀剂的沉淀剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白 质、核酸、

32、多糖等生物大分子的沉析；质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围 不广不广 沉淀技术 1、温度、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使 溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋 白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止 溶液局部升温。溶液局部升温。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，温度还会影响

33、有机溶剂对蛋白质的沉淀能力， 一般温度越低，沉淀越完全。一般温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先因此，所用的有机溶剂须预先冷却冷却到到-10- 20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整 个操作过程应在低温下进行个操作过程应在低温下进行 。 有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素 沉淀技术 2、pH值值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3、样品浓度：样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损 耗；样品太浓会增加共沉作用耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋

34、白质的初。一般认为蛋白质的初 浓度以浓度以0.52为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以12较合适。较合适。 4、中性盐浓度中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用， 减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L 为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5、某些金属离子某些金属离子：一些金属离子如：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与等可与 某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物 溶解度大大降低而不影响

35、生物活性，有利于沉淀形成，溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成， 并降低溶剂用量。并降低溶剂用量。 有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素 沉淀技术 非离子型聚合物非离子型聚合物 用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶 解度，有选择性的沉淀蛋白质。解度，有选择性的沉淀蛋白质。 机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白 质的水化膜。质的水化膜。 常用非离子性聚合物为常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)： 是一种水溶性的高分子聚合物，分子量是一种水

36、溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上以上 的的 PEG 可以用来沉淀蛋白质。可以用来沉淀蛋白质。 优点：优点： 1. 室温室温 2. 颗粒大，易于收集颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而难去除，幸而 PEG 通常一般不影响下一步通常一般不影响下一步 的分离。的分离。 沉淀技术 机理：架桥与静电机理：架桥与静电 离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、 海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。 合成的离子聚合物：合成的离子聚合物： 聚丙烯酸（聚丙烯酸（pH 2.8 90%pH 2.8

37、90%蛋白沉淀）蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% pH 10.4, 95% 蛋白沉淀）蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺 聚电解质沉淀聚电解质沉淀 沉淀技术 此类沉析剂有以下三种：此类沉析剂有以下三种： （1）高价金属盐：）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+， Ca2+与酸性基团结合；与酸性基团结合； （2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基 团结合团结合 （3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用缺点：容易导致活性

38、蛋白的不可逆变性，需采用 较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。 沉淀技术 ） 金属离子沉淀金属离子沉淀 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中 的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基 中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到 1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋 白的特异相互作用的

39、研究中得到的。白的特异相互作用的研究中得到的。 Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和）用于分离乳酸，血清蛋白和 柠檬酸。柠檬酸。 硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于， MgSO4用以去除用以去除DNA和其他核酸；和其他核酸； 沉淀技术 金属离子沉淀蛋白质金属离子沉淀蛋白质 一般可分三类：一般可分三类： 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强 烈结合的一些金属离子，如：烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、 Fe2+

40、、 o2+、 Ni2+ 、 u2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子， 如：如：Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; 能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 实际应用时，金属离子的浓度常为实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中。复合物中 金属离子的去除，可用离子交换法或金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂金属螯合剂。 沉淀技术 2有机盐法有机盐法 含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、

41、鞣酸等能与有机分子含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子 的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 但此法常发生但此法常发生 不可逆的沉淀反应不可逆的沉淀反应 3无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。 以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。 若沉淀为金属复合盐，可通以若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成硫化物而使金属变成硫化物而 除去；除去； 若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃 取，把有机酸和磷钨酸等

42、移入乙醚中除去，或用离子取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子 交换法除去。交换法除去。 沉淀技术 亲和沉淀亲和沉淀 affinity precipitation u亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原 理与通常的沉淀方法有很大的不同。理与通常的沉淀方法有很大的不同。 u它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫 配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互 作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术 u所以所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异， 而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶有特殊蛋白质的聚合物的溶 解度的大小。解度的大小。 沉淀技术 亲亲 和和 沉沉 淀淀 亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取 单一产品的有效方法。单一产品的有效方法。