土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定试验方案

1、土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院班级：XXX班姓名/学号：1.实验目的与要求：1) 了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2) 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3) 掌握微生物淀粉酶活力测定的原理及方法；4) 培养自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5) 对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6) 从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。2.实验原理2.1实验中通过80水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀

2、释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。2.2淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、 医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。目前,在饲料行业由于芽孢杆菌对动物独特的生物学效应,对于高产淀粉酶的芽胞杆菌在动物饲料上应用的研究取得一定进展。配合饲料中含有淀粉 、 蛋白质 、 脂肪、纤维素 、 半纤维素、果胶等多种营养成分,这些营养成分都是由生物多聚物组成,必须依靠水解酶类将其酶解

3、,才能被动物肠道吸收 。在饲料中起作用的淀粉酶主要是 -淀粉酶和糖化酶( 葡萄糖淀粉酶) , -淀粉酶是将大分子淀粉水解成中等和低分子物质,产生大量新的非还原性末端,有利于糖化酶进一步水解,糖化酶则将 -淀粉酶水解出的一些中、低分子产物 ,从非还原性末端开始,逐次切下一个个能被动物直接吸收利用的葡萄糖。以芽孢杆菌作为饲料添加剂,一方面芽孢杆菌产生淀粉酶促进饲料中含淀粉营养成分的降解,充分被动物吸收利用; 另一方面芽孢杆菌进入消化道能提高内源酶的活性。尤其在动物开始断奶时,因其体内淀粉酶等含量低,不能满足生长发育的需求,若不及时补充淀粉酶等,则会造成消化不良,影响生长发育。所以高产淀粉酶芽孢杆菌

4、的选育已成为饲料行业的一个新突破点.3.实验材料、设备及方法3.1.土壤采样地点：体育馆外草地、生化楼楼下（挑取2个不同地点）采用五点采样法来采样，各个采样点均采取土样10g左右(每个土样共40g)。用已事先灭菌的取样铲，将各个采样点的表层5cm左右的土除去，取5-15cm处的土样40g，装入事先准准备好的三个塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件，分别记做A土样、B土样。一般样品取回后应马上分离,以免致微生物死亡.3.2染色材料：通用：吸水纸、香柏油3.2.1单染色：无菌水、草酸铵结晶紫染液（或石炭酸复红染液）3.2.2革兰氏染色：无菌水、草酸铵结晶紫染

5、液、路哥氏碘液、95%酒精、石炭酸复红染色液3.2.3芽孢染色：吸水纸、香柏油、无菌水、草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、95%酒精、石炭酸复红染色液、5%孔雀绿3.3 培养皿的配方3.3.1高盐培养基（牛肉膏蛋白胨液体培养基）（盐浓度2%、5%、7%、10%）（耐盐试验）配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠3g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.07.2（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000 mL，pH 7.27.4代替）3.3.2牛肉膏蛋白胨培养基（耐高温试验）（温度梯度为10、20、30、40、50、60、70）配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠3g、琼脂15g

6、、蒸馏水1000ml、pH7.07.2（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000 mL，pH 7.27.4 代 替）处理：灭菌1.05kg/cm2,2030min3.3.3糖发酵培养基（作糖酵解试验用）配方：蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1.6%溴麝香草酚蓝水溶液2 ml（或者1 %溴麝香草酚蓝水溶液3 ml），待试糖10 g或15g(葡萄糖10g,而乳糖或半乳糖15g)，自来水1000 ml，pH 7.27.4；3.3.4葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验）配方：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4，

7、处理：121 灭菌20 min；3.3.5蛋白胨水培养基（吲哚实验）配方：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4处理：121 灭菌20 min；3.3.6淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（淀粉水解试验）：配方：可溶性淀粉2g，牛肉膏3g,蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，自来水1000ml，pH 7.27.4；（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000 mL，pH 7.27.4代替）3.3.7柠檬酸培养基配方：NH4H2PO4 1g、K2H2PO4 1g、氯化钠5g、MgSO4H2O 0.2g、柠檬酸钠2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、

8、1%溴麝香草酚蓝酒精液10mL、pH7.2处理：121灭菌15min3.3.8半固体培养基（运动性实验）配方：0.5g琼脂，牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl0.5g ，水100ml ，pH 7.27.4；3.3.9明胶培养基（做明胶液化试验用） 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 mL ，pH 7.0；3.3.10酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用） L酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板； 3.3.11酪素平板（作酪素水解试验用） 取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1

9、.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板；3.3.12西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用） 柠檬酸钠2 g，NaCl 5 g，MgSO47H20 0.2 g, K2HPO43H20 1 g,(NH4)2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂1520 g，自来水1000 ml，pH 7.0 , 121 灭菌20 min；3.3.13淀粉筛选培养基 淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。3.4各个生化试验需要用到的试剂：3.4.1耐盐性试验：NaCl

10、粉末。3.4.2糖酵解实验：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。3.4.3革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。3.4.4芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。3.4.5V.P试验（MR试验）：40%NaOH 溶液，-奈酚。3.4.6吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。3.4.7碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL。3.4.8单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。3.4.9硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）；3.4.10酪素水解：脱脂奶粉。 酪氨酸水解：L-酪氨酸

11、。3.4.11卵黄反应：新鲜鸡蛋。3.4.12硝酸盐试验：硝酸盐3.4.13明胶液化试验：明胶3.4.14柠檬酸盐利用试验：西蒙斯氏柠檬酸盐3.4.15酶活力的测定所用试剂 3, 5- 二硝基水杨酸、2mol/ L 氢氧化钠、蒸馏水、四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO64H2O)、淀粉、pH 值5.6 的柠檬酸缓冲液、柠檬酸缓冲液( pH 值6.0)、pH 值3.6 以下的酸钝化- 淀粉酶3.5、实验所用仪器、设备：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸，涂布器，显微镜，移液管，移液枪等。 恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，恒温水浴箱，磁力

12、搅拌器等4.实验材料、设备及方法4.1土壤悬液制备各称取10g 土壤样品于装有90ml 无菌水的锥形瓶中，加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡5min ,即为稀释10-1倍的土壤悬浮液,做好标记。4.2去除无芽孢细菌利用恒温水浴装置对土壤悬液进行80，20min的水浴，杀死悬液中无芽孢的细菌。4.3土壤悬液梯度稀释梯度稀释：另取9支空试管，各加入9ml 0.85%生理盐水（配制好后需灭菌），分别编号10-2, 10-3, 10-4, 10-5。振荡混匀已稀释成10-1的土壤悬液,用移液枪吸取1mL土壤悬液加入编号为10-2的装有生理盐水的试管中,并轻轻震荡试管,使之充分混匀,即成10-2土壤稀释液。同

13、理从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的生理盐水试管中,混匀后即为10-3土壤稀释液,依次连续稀释得10-4, 10-5，并做好标记。取10-2, 10-3, 10-4, 10-5这四个稀释度进行稀释涂布平板操作。4.4用选择培养基初步筛选：4.4.1涂布用无菌移液器从各浓度的土壤稀释液取50ul与筛选培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂布，充分涂布均匀。每个浓度2各平板，其中一个空白对照，并将接种完成后的平板置于37 恒温箱，倒置培养24h.4.4.2筛选从各个土壤悬液稀释度的涂布平板上挑取直径较大的单菌落10个，于新的筛选培养基中进行分区划线4.5分离纯化（进一步）4.5.1分区

14、划线法纯化用接种环挑取10个较大菌落于筛选培养基中进行分区划线。其步骤为：平板划线法接种：以无菌操作于合适浓度（看哪个浓度的培养基最可能产生单菌落）的培养基中挑取不同单菌落进行分区划线。划线接种：培养基分成A、B、C、D四个区，先在平板培养基的A区做第1次平行划线3-4条，再转动培养皿60度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后第2次划线以第1次划线的尾部开始，在B区划线，再用同法进行第3和第4次划线，划线完毕，盖上皿盖，倒置于37C下恒温培养约24h.。再接着分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用实验4.6染色（鉴定

15、是否为纯培养）在分区划线第四次后,取所得到的菌株做单染色，革兰氏染色，芽孢染色并镜检。判断所得到的菌株是否为芽孢杆菌。染色方法：4.6.1单染色：涂片：在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑少许菌于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜；干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥；固定：涂面朝上，通过微火2-3次；染色：待玻片泠却后加结晶紫（或者石炭酸复红）1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟；水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）；干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干；镜检：油镜观察并绘图。4.6.2革兰氏染色：涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上

16、一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。固定：涂面朝上，通过微火2-3次。初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。 镜检：观察染色结果图。4.6.3芽孢染色：涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。干燥：将涂片置火焰

17、高处微热烘干或自然干燥。固定：涂面朝上，通过微火2-3次。加温染色：加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分钟。水洗 将玻片冷却，水洗直到流出的水中无绿色为止。常温复染：加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸去余水。镜检：用油镜观察绘图。若没获得纯培养,继续进行分区划线,再镜检.直到获得纯培养.若镜检后,得知已得到纯培养,则进行下一步操作。4.7初步判断菌株种类仔细记录下不同菌株的形态学特征，查阅伯杰士手册大概判断所得菌株的种类。安排往后的实验。4.8生理生化鉴定可以选择做糖发酵试验，IMVIC实验，运动性实验等，以鉴定所获得的菌株的确切种类。4.8.1糖发酵实验：根

18、据所获菌株的数量取适当数目的葡萄糖（乳糖）发酵管（留一支做空白对照）。以无菌操作将菌株接入管中，置于37恒温箱中培养2448H。观察实验结果并记录。4.8.1IMVIC实验将菌株分别接入葡萄糖蛋白胨水培养液中，37恒温培养48H。将培养液分成两份。4.8.1.1V-P实验将其中1半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入5-10滴 40%KOH，然后加入等量的 5%-萘酚溶液，用力振荡，再放入 37温箱中保温 15-30min。若培养物呈红色者，为VP 试验反应阳性4.8.1. 2MR实验将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变黄色者为阴性。 4.8.2吲哚实验将菌株

19、分别接种到蛋白胨水培养液中，37恒温培养48h后取出往各试管内加入乙醚1-2mL，用力振荡，静置分层后，沿管壁缓缓加入5-10滴吲哚试剂，若上层乙醚层呈玫瑰红色者，为吲哚试验反应阳性。可根据需要选择做耐盐性试验，耐高温试验，硝酸还原试验等一系列试验以鉴定菌株。4.8.3耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为（2%、5%、7%、10%）的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37下划线培养3d,观察生长情况。4.8.4耐高温试验： 将菌种接种到牛肉膏蛋白胨中，分别在5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60条件下培养24小时，观察细菌是否生长。4.8.5硝酸还原试验：甲液（

20、对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养l4d.将甲、乙液等量混合后（约0.1mL）加入培养基内，立即观察结果。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。4.8.6运动性试验：使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺

21、到离管底11.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针。于37温箱培养24h，观察是否产生树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌株无鞭毛。4.8.7柠檬酸盐利用试验：取装柠檬酸盐培养基斜面的试管，分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性（+），若培养基无变色，则为阴性（-）。4.8.8淀粉水解试验：选用淀粉牛肉膏培养基,点接已经纯化的芽孢杆菌于平板上,检验是否产淀粉酶，若菌落周围有无色透明圈，说明有胞外淀粉酶产生。4.8.9明胶液化试验 穿刺接种，深度至明胶层2/3处，于37温箱培养24h.。

22、取出静置冰箱中待其凝固后，再观察其是否被细菌液化，如被液化,则为阳性,能产生蛋白酶。4.8.10酪素水解试验（酪蛋白水解） 牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接35株菌。37培养，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。4.8.11酪氨酸水解实验 将营养琼脂融化，冷却至温热，与L-酪氨酸混匀，分别将菌种点接在平板上，37培养24h。记录菌落周围是否有透明圈，若有，则菌株能够水解酪氨酸

23、。 4.8.12卵黄反应试验 步骤：取18-24h的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上，点的直径约为2-3mm。每个平板可分散点5-7株菌，以不影响观察为宜，适温培养18-24h观察。如菌落四周和下面有不透明的区出现，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。从伯杰氏手册中整理出：（四）淀粉酶活力的测定1）标准曲线的制作(见下表)取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。表1 标准麦芽糖溶液

24、成分表及OD测定值试剂1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。按以下顺序操作：取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml于各只试管中，于

25、60水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60水中预热5min，取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入试管中,于60水浴中保温30min加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20 ml。摇匀,用分光光度计测定OD520 nm值。在上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力酶活力测定公式： 淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg）淀粉酶原液总体积（mL）/所加淀粉质量每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：表2样品酶活力测定步骤反应顺序样品（重复3个）样品空白标准空白样品稀释液（ml）110蒸馏水00160预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60保温30min依次加入DNS试剂（ml）1.51.51.5混合100煮沸5min加入0.4m