用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产

1、 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 2 前前 言言 对微生物的代谢途径及代谢网络进行对微生物的代谢途径及代谢网络进行 有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然 是现代生物工程学的一个主攻目标。为了是现代生物工程学的一个主攻目标。为了 攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完 善的细胞生理学、生物化学、分子生物学善的细胞生理学、生物化学、分子生物学 及生物过程工程等学科的基本状况做一番及生物过程工程等学科的基本状况做一番 描述，主要有如下几个话题描述，主要有如下几个话题: 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 3 与生物

2、工程相关的氨基酸产生与生物工程相关的氨基酸产生 菌的相关途径的研究进展情况，菌的相关途径的研究进展情况， 其中必须包括这些途径的其中必须包括这些途径的代谢调代谢调 节以及细胞的整个调节网络节以及细胞的整个调节网络的研的研 究进展情况。究进展情况。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 4 对所有的相关途径进行详细的对所有的相关途径进行详细的代谢流代谢流 量分析量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架。这涉及到基质进入细胞的碳架 物流量，流经向心途径、中心代谢途径物流量，流经向心途径、中心代谢途径 和离心途径的碳架物流量，以及代谢中和离心途径的碳架物流量，以及代谢中 间产物流出细胞的间产物流出细胞

3、的碳架物流量碳架物流量 （ the central and peripheral carbon fluxes）。）。 还原力的流量还原力的流量 （ redox flux ）及及能量流能量流 量量（energy flux）。）。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 5 以协调和调节的方式以协调和调节的方式对碳架流、氧对碳架流、氧 化还原反应的电子流、能量流进行导化还原反应的电子流、能量流进行导 向向，以提高基质的吸收能力，以提高基质的吸收能力、限制前限制前 体物向支路途径的流量、减少中间产体物向支路途径的流量、减少中间产 物的积累及副产物的形成，还要绕过物的积累及副产物的形成，还要绕过 氧

4、化还原平衡及能量平衡中可能出现氧化还原平衡及能量平衡中可能出现 的难题。的难题。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 6 传统的设计育种（传统的设计育种（ 随机诱变加定随机诱变加定 向筛选），以及向筛选），以及DNA重组技术在设计重组技术在设计 育种中的应用已经大大提高了育种中的应用已经大大提高了 微生物微生物 对氨基酸的生产能力，对氨基酸的生产能力， 但人们对于氨但人们对于氨 基酸产生菌的基酸产生菌的生理学生理学与与生物化学生物化学等等 主主 要领域的基础知识还相当匮乏。要领域的基础知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面理解氨基酸目前可从以下几方面理解氨基酸 的代谢基础：的代谢基础： 2

5、021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 7 具有生物工程学重要性的微生物的具有生物工程学重要性的微生物的 基本代谢途径基本代谢途径及其对应的及其对应的酶的性质酶的性质； 酶及其酶及其调节方式调节方式，途径及其调节方，途径及其调节方 式；式； 中心代谢途径及离心途径代谢中心代谢途径及离心途径代谢流量流量 的定量分析的定量分析； 对对跨膜传送跨膜传送（基质吸收和产物分泌）（基质吸收和产物分泌） 的详尽的了解。的详尽的了解。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 8 目的产物的合成途径是理解氨基酸目的产物的合成途径是理解氨基酸 生产的前提和核心内容生产的前提和核心内容 。相关的代谢途。相关的代谢

6、途 径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸 的合成的专用途径，也包括提供前体碳的合成的专用途径，也包括提供前体碳 架物的途径、从专用途径分流最终导致架物的途径、从专用途径分流最终导致 副产物生成的分支途径、相应氨基酸自副产物生成的分支途径、相应氨基酸自 身被降解的途径、以及那些身被降解的途径、以及那些提供还原力提供还原力 和代谢能量的途径。和代谢能量的途径。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 9 除了以上这些反映代谢途径基本除了以上这些反映代谢途径基本 信息的资料外，代谢流量的相对固定信息的资料外，代谢流量的相对固定 的分布以及代谢流量的动力学响应同的分布

7、以及代谢流量的动力学响应同 样是至关重要的。这既涉及到中心代样是至关重要的。这既涉及到中心代 谢途径（提供碳架物质、还原力及代谢途径（提供碳架物质、还原力及代 谢能）的代谢流的定量分析，又涉及谢能）的代谢流的定量分析，又涉及 到特定氨基酸专用的合成途径的代谢到特定氨基酸专用的合成途径的代谢 流的定量分析。流的定量分析。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 10 此外，基质吸收和目的产物输出等此外，基质吸收和目的产物输出等 有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产 也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般 工业微生物基质吸收方面的知识

8、是相当工业微生物基质吸收方面的知识是相当 欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近 年才受到关注。方向性的跨膜反应的机年才受到关注。方向性的跨膜反应的机 理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等 方面的知识对于理解氨基酸生产过程也方面的知识对于理解氨基酸生产过程也 是相当重要的。是相当重要的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 11 我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的 代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量 分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生分析对于了解细胞生理的意

9、义和氨基酸生 物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输 送方面为数不多的研究工作，以及这方面送方面为数不多的研究工作，以及这方面 研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。 在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的 微生物代谢设计的新进展和新方法。微生物代谢设计的新进展和新方法。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 12 1. 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础 2. 氨基酸生物合成的代谢流量氨基酸生物合成的代谢流量 分析分析 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的基质的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输

10、出跨膜输出 4. 氨基酸生产的代谢设计氨基酸生产的代谢设计 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 13 1.氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础 1.1 氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成 1.2 代谢产物生产的生理学代谢产物生产的生理学 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 14 1. 1 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础 氨基酸的生物合成涉及以下氨基酸的生物合成涉及以下5个方面：个方面： （1）基质吸收；）基质吸收； （2）进入中心代谢途径前的准备途径；）进入中心代谢途径前的准备途径； （3）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨 基酸的前体化

11、合物）、还原力（如基酸的前体化合物）、还原力（如NADPH、 NADH ）和代谢能（和代谢能（ ATP 和磷酸烯醇式丙和磷酸烯醇式丙 酮酸等）；酮酸等）； 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 15 （4）通过同化（）通过同化（ 合成）合成） 途径将碳途径将碳 架化合物转化成目的氨基酸，此过架化合物转化成目的氨基酸，此过 程涉及到还原力与代谢能的供需平程涉及到还原力与代谢能的供需平 衡，同时也涉及主要载流途径与分衡，同时也涉及主要载流途径与分 支途径之间的关系；支途径之间的关系； （5）目的氨基酸的跨膜输出等；）目的氨基酸的跨膜输出等； （6）目的产物进一步代谢的途径。）目的产物进一步代谢

12、的途径。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 16 谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成 是研究得最为广泛的。是研究得最为广泛的。图图 2 列出了列出了 谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物 合成相关的途径及重要步骤的代谢合成相关的途径及重要步骤的代谢 调节情况。调节情况。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 17 基质 基质 异化途径 同化途径 氨基酸 副产物 降解途径 氨基酸 全 局 调 节 系 统 跨膜吸收 碳架、还原力、代谢能 跨膜输出 重吸收 反馈 调节 图图1. 微生物细胞合成氨基酸的微生物细胞合成氨基酸的 相关途径及代谢调节示意

13、图相关途径及代谢调节示意图 其中，各相关酶及其中，各相关酶及 途径水平上的代谢调节，途径水平上的代谢调节， 以及整个细胞水平上的以及整个细胞水平上的 全局调节对于代谢流的全局调节对于代谢流的 导向和改造是至关重要导向和改造是至关重要 的。对微生物整个代谢的。对微生物整个代谢 网络进行有目的的改造网络进行有目的的改造 和设计涉及到大范围的和设计涉及到大范围的 遗传改造。遗传改造。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 18 该同化（合成）途径通过草酰乙酸该同化（合成）途径通过草酰乙酸 （OAA）与中心代谢途径相接，天冬氨与中心代谢途径相接，天冬氨 酸是该族氨基酸的共同前体物。酸是该族氨基酸的

14、共同前体物。 来自回来自回 补途径及补途径及TCA 环的草酰乙酸，环的草酰乙酸， 进入合进入合 成途径并在天冬氨酸成途径并在天冬氨酸 - 半醛（半醛（ ASA） 处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另 一条通往苏氨酸、蛋氨酸（一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸甲硫氨酸 ） 及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天 冬氨酸激酶（冬氨酸激酶（ AK ），），其他重要的酶包其他重要的酶包 括高丝氨酸脱氢酶（括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸和苏氨酸 脱氢酶（脱氢酶（TDH）。）。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 19 再往后的

15、流量控制点是是通往赖再往后的流量控制点是是通往赖 氨酸氨酸 DDP合酶（见图中合酶（见图中DHDPS） 以以 及赖氨酸的需能输出。要获得令人满及赖氨酸的需能输出。要获得令人满 意的结果，必须全面考虑这些方面，意的结果，必须全面考虑这些方面， 仅仅对于个别反应（即便是最重要的仅仅对于个别反应（即便是最重要的 调控点）进行改造并不是理想的方法，调控点）进行改造并不是理想的方法， Broer 等曾将脱敏的等曾将脱敏的 AK 的基因导入的基因导入 野生菌中进行表达，但并未获得很令野生菌中进行表达，但并未获得很令 人满意的赖氨酸产量。人满意的赖氨酸产量。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 20

16、该途径上另一值得关注的该途径上另一值得关注的 特征是从六氢吡啶二羧酸出发特征是从六氢吡啶二羧酸出发 合成二氨基庚二酸的旁路途径合成二氨基庚二酸的旁路途径 的出现，借助于的出现，借助于 NMR 手段已手段已 经得知，旁路的出现依赖于某经得知，旁路的出现依赖于某 些代谢条件，特别是可利用的些代谢条件，特别是可利用的 NH4+的存在。的存在。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 21 另一个重要的方面是参与特定另一个重要的方面是参与特定 氨基酸合成途径及与之相关的其他氨基酸合成途径及与之相关的其他 代谢途径的代谢途径的酶的调节特性酶的调节特性，包括酶，包括酶 活力的调节和酶的表达的调节。特活力

17、的调节和酶的表达的调节。特 别是必须详细研究中间产物或终端别是必须详细研究中间产物或终端 产物对途径起点或分支处的关键酶产物对途径起点或分支处的关键酶 的调节。的调节。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 22 图图2 2. . 天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节. (其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏) IR 缩写符号：缩写符号： ASA为天门冬氨酸为天门冬氨酸-半醛，半醛， H s e 为 高 丝 氨 酸 ，为 高 丝 氨 酸 ， SucAKPA为琥珀酰二氨为琥珀酰二氨 基庚二酸；基庚二酸；AK为天冬氨为天冬氨 酸激酶，酸激酶，DHDPS为二氢为二氢 吡啶二羧酸合酶，吡啶二羧酸合酶，H

18、DH 为高丝氨酸脱氢酶，为高丝氨酸脱氢酶，HK 为高丝氨酸激酶，为高丝氨酸激酶，TDH为为 苏氨酸脱氢酶，苏氨酸脱氢酶，AHAS为为 乙酰羟酸合酶；乙酰羟酸合酶； PEPS为为 PEP合成酶，合成酶，PK为丙酮为丙酮 酸激酶，酸激酶，PC为丙酮酸羧为丙酮酸羧 化酶，化酶，OAADC为草酰乙为草酰乙 酸脱羧酶，酸脱羧酶，PEPC为为PEP 羧化酶，羧化酶，PEPCK为为PEP 羧激酶。羧激酶。 PYR AcCoA OAA TCA CTA HDH hom DHDPS dapA Asp Asp-P AK lysC ASAHse I Met DDP SucAKPA DAP Lys HK thrB Il

19、e Thr TDH ilvA AHAS ilvBN I Thr Lys IThr MetR MetR Ile，Leu,ValR IleI IleI EMP PEP PEPC PEPCKPC OAADC PK PEPS GlcG6P PTS奇异三角区 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 23 要想根据细胞粗提取液的测定要想根据细胞粗提取液的测定 结果对这些酶的调控性质做出适当结果对这些酶的调控性质做出适当 的解释是靠不住的。的解释是靠不住的。这一方面是因这一方面是因 为它们在这些条件下可能不稳定；为它们在这些条件下可能不稳定； 另一方面，对于需要什么样的辅因另一方面，对于需要什么样的辅因

20、子才能保持它们的活性或（和）它子才能保持它们的活性或（和）它 们在缓冲液中的稳定性，也知之甚们在缓冲液中的稳定性，也知之甚 少；而且特别是因为在抽提的过程少；而且特别是因为在抽提的过程 中，那些参与胞内酶活性调节的必中，那些参与胞内酶活性调节的必 需因子会丢失。需因子会丢失。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 24 谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酸棒杆菌中存在 - 酮戊二酮戊二 酸脱氢酶便是一例。酸脱氢酶便是一例。人们最初认为人们最初认为 这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。 正因为如此，才出现了这样的假设，正因为如此，才出现了这样的假设， 即：即：TCA 环在该处

21、的中断引起环在该处的中断引起 - 酮戊二酸的酮戊二酸的 “ 溢出溢出 ”， 最终导致最终导致 谷氨酸的分泌谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶后来才弄清这个酶 在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的， 但是它似乎很不稳定但是它似乎很不稳定。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 25 另外，另外，在关于代谢流的研究中在关于代谢流的研究中 有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中- 酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了 （dawn-regulated），）， 但这在细胞但这在细胞 抽提物中至今不能得到证实。进行抽提物中至今不能得到证实

22、。进行 详细的代谢流量（包括相关中间产详细的代谢流量（包括相关中间产 物的流量）分析，或许是解决这一物的流量）分析，或许是解决这一 问题的唯一办法。问题的唯一办法。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 26 正确描述代谢网络的主要节点的正确描述代谢网络的主要节点的 调控模式是十分必要的，但常常是十调控模式是十分必要的，但常常是十 分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和 磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就 是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、 PYR和和OAA所构成的所构成的 “ 奇异三角区奇异三角区 ”

23、（magic triangle）是研究的热点是研究的热点 。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 27 Glc PEP PYR AcCoA OAA G6P Glc 注：注： PK, PC, PEPC, PEPCK, OAADC, PEPS, PTS 奇异三角区奇异三角区 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 28 PEP通过通过PYR和和AcCoA向向TCA 环提供环提供C2单位，同时，单位，同时，PEP、PYR 以及以及 AcCoA 还还通过回补反应通过回补反应（ 通通 过乙醛酸环）为过乙醛酸环）为TCA环提供重要中环提供重要中 间产物，这些回补反应对于以间产物，这些回补反应对于以

24、TCA 环代谢中间产物环代谢中间产物 为前体的氨基酸的为前体的氨基酸的 生产来说是非常必要的。生产来说是非常必要的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 29 该区包含可能有多达七个酶的参与，该区包含可能有多达七个酶的参与， 其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、）、 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、）、 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 （ PK ）、）、 草酰乙酸脱羧草酰乙酸脱羧 酶酶 （OAADC ）和磷酸烯醇式丙酮酸磷和磷酸烯醇式丙酮酸磷 酸转移酶系统（酸转移酶系统（PTS）都已得到鉴定，都已得到鉴定， 磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（

25、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ）已已 被假定存在。丙酮酸羧化酶（被假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ）的的 存在已得到代谢流量分析的实验数据的存在已得到代谢流量分析的实验数据的 支持。支持。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 30 合成代谢途径通常受反馈抑制和合成代谢途径通常受反馈抑制和 反馈阻遏的严格调控，比如反馈阻遏的严格调控，比如 图图2 中的中的 AK、HDH、TDH、AHAS等。等。 不过，不过， 相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌 中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途 径的调节还是比较简单的。径的调节还是比较简单

26、的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 31 研究表明，仅仅研究与合成途径直研究表明，仅仅研究与合成途径直 接相关的酶的调节以及还原力和能量的接相关的酶的调节以及还原力和能量的 供给，以及对供给，以及对“瓶颈瓶颈”处关键酶的处关键酶的解调解调 节节或或过量表达过量表达仍是不够的。中心代谢途仍是不够的。中心代谢途 径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途 径，同全局调控机制密切相关，如紧缩径，同全局调控机制密切相关，如紧缩 控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、 渗透压调节及生长阶段调节等。这些问渗透压调节及生长阶段调节等。这

27、些问 题对于氨基酸的合成非常重要，但对它题对于氨基酸的合成非常重要，但对它 们了解得并不多。们了解得并不多。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 32 氨基酸的生产中经常用到特定氨基酸的生产中经常用到特定 的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面， 在分成两支的氨基酸合成途径中，在分成两支的氨基酸合成途径中， 一个分支途径的终端产物氨基酸的一个分支途径的终端产物氨基酸的 营养缺陷，通常对另一分支的终端营养缺陷，通常对另一分支的终端 产物氨基酸的合成起促进作用。产物氨基酸的合成起促进作用。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 33 (其中 表示反馈抑制； 表示反

28、馈阻遏) 图图3.3.天冬族氨基酸过量合成的机理 IR PYR AcCoA OAA TCA CTA HDH hom DHDPS dapA Asp Asp-P AK lysC ASAHse I Met DDP SucAKPA DAP Lys HK thrB Ile Thr TDH ilvA AHAS ilvBN I Thr Lys IThr MetR MetR Ile,Leu,Val R IleI IleI EMP PEP PPC PCKPC ODC PK PPS GlcG6P PTS 比如图比如图 3 中，谷中，谷 氨酸棒杆菌中高氨酸棒杆菌中高 丝氨酸缺陷或苏丝氨酸缺陷或苏 氨酸缺陷的赖氨氨酸

29、缺陷的赖氨 酸生产菌株，大酸生产菌株，大 肠杆菌中甲硫氨肠杆菌中甲硫氨 酸缺陷、二氨基酸缺陷、二氨基 庚二酸缺陷或异庚二酸缺陷或异 亮氨酸缺陷的苏亮氨酸缺陷的苏 氨酸生产菌株。氨酸生产菌株。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 34 另一方面，某些化合物另一方面，某些化合物对菌对菌 体生长的限制体生长的限制，不论是氨基酸或，不论是氨基酸或 其他化合物（其他化合物（ 比如磷酸盐比如磷酸盐 ）, 都都 可能成为有利于特定生物过程的可能成为有利于特定生物过程的 最优控制的技术条件。最优控制的技术条件。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 35 尽管连续培养得到的结果表尽管连续培养得到的结

30、果表 明，赖氨酸的生成是与细胞的生明，赖氨酸的生成是与细胞的生 长是相关联的。但长是相关联的。但在在有效分泌有效分泌的的 生理条件下，氨基酸生产菌一般生理条件下，氨基酸生产菌一般 都处于生长受限制的状态。都处于生长受限制的状态。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 36 然而，对于与生长限制相关的中心然而，对于与生长限制相关的中心 代谢（代谢（ central metabolism ） 和外围代和外围代 谢（谢（peripheral metabolism） 的改变如的改变如 何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚； 这或许与影响到许多不同的基因和操纵这或许

31、与影响到许多不同的基因和操纵 子的调节网络子的调节网络 （ regulatory networks ) 的作用有关。的作用有关。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 37 谷氨酸的生产可以建筑在完全谷氨酸的生产可以建筑在完全 不同的细胞代谢态势下。许多方法不同的细胞代谢态势下。许多方法 可诱导其分泌，包括生物素饥饿法可诱导其分泌，包括生物素饥饿法 （用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌（用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌 是生物素缺陷型）、添加胺类表面是生物素缺陷型）、添加胺类表面 活性剂、在菌体生长期添加青霉素、活性剂、在菌体生长期添加青霉素、 甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件甘油或脂肪酸缺陷菌株在限

32、制条件 下生长等。下生长等。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 38 很显然，所使用的这些很显然，所使用的这些 方法都对细胞质膜或细胞壁方法都对细胞质膜或细胞壁 有一定影响，但使细胞膜通有一定影响，但使细胞膜通 透性发生变化的机理是不完透性发生变化的机理是不完 全一样的。全一样的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 39 谷氨酸的分泌曾被认为是因为相谷氨酸的分泌曾被认为是因为相 对简单和直接的代谢改变（即影响细对简单和直接的代谢改变（即影响细 胞膜性质）的而引起的，然而最近发胞膜性质）的而引起的，然而最近发 现在没有紧缩效应的大肠杆菌（现在没有紧缩效应的大肠杆菌（rel A 基

33、因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可 以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分 泌活性，这表明全局调节机制对分泌泌活性，这表明全局调节机制对分泌 的影响是存在的。的影响是存在的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 40 1.2 氨基酸生产的微生物生理学氨基酸生产的微生物生理学 对于经氧化还原过程实现氨基酸对于经氧化还原过程实现氨基酸 生产的重要性，早有所认识。但对其生产的重要性，早有所认识。但对其 中大多数现象（至少在分子水平上）中大多数现象（至少在分子水平上） 仍未很好理解。对一般的代谢调节现仍未很好理解。对一般的代谢调节现 象做如下

34、五点概述，可能将有利于我象做如下五点概述，可能将有利于我 们从生理学的角度去理解代谢中间产们从生理学的角度去理解代谢中间产 物的生产。物的生产。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 41 （1） 氨基酸的生产与菌体生长之间氨基酸的生产与菌体生长之间 的关系尚未解决（耦合与否？）。的关系尚未解决（耦合与否？）。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 42 （2） 限制生长条件下的微生物生理。限制生长条件下的微生物生理。 在缓慢生长或非生长条件下，有目的在缓慢生长或非生长条件下，有目的 地控制基质的吸收与代谢的速率，能地控制基质的吸收与代谢的速率，能 提高发酵工业生产效率。因此，要用提高

35、发酵工业生产效率。因此，要用 分子技术或生化技术对此进行深入细分子技术或生化技术对此进行深入细 致的研究，以阐明在限制生长条件下，致的研究，以阐明在限制生长条件下， 微生物的生理背景同工业生物过程的微生物的生理背景同工业生物过程的 应用必定密切相关的道理。应用必定密切相关的道理。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 43 （3）溢出代谢的概念：）溢出代谢的概念： 当这个生当这个生 理学的新见识同过量生产的特定代理学的新见识同过量生产的特定代 谢条件，在分子水平上发生相互关谢条件，在分子水平上发生相互关 联的时候，溢出代谢（联的时候，溢出代谢（overflow metabolism）的概念

36、是值得关注的。的概念是值得关注的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 44 例如，在过量生产某种产物的代谢例如，在过量生产某种产物的代谢 条件下，已观察到某些特有的代谢中间条件下，已观察到某些特有的代谢中间 产物，如产物，如 丙酮酸、丙酮酸、 - 酮戊二酸酮戊二酸等，会等，会 大量分泌。这些特定的代谢中间产物先大量分泌。这些特定的代谢中间产物先 在细胞内累积（这取决于碳源的性质和在细胞内累积（这取决于碳源的性质和 生长限制），然后分泌到细胞外（如果生长限制），然后分泌到细胞外（如果 细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机 构或有输送系统存在），从而构或有输

37、送系统存在），从而抵消在碳抵消在碳 架物质、还原当量和代谢能等在代谢中架物质、还原当量和代谢能等在代谢中 的不平衡。的不平衡。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 45 （4）代谢不平衡：）代谢不平衡： 细胞的代谢不平衡指碳细胞的代谢不平衡指碳 架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量 的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到溢溢 流阀流阀（ overflow valves ）的功能。事实上，的功能。事实上， 代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下 （如大量氨基酸的过量合成（如大量氨基酸

38、的过量合成 ）得以维持，）得以维持， 是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和 代谢能限制的条件下代谢能限制的条件下 ）耦合在一起的代谢耦合在一起的代谢 流流脱钩脱钩的灵活性的灵活性。 好几个术语，如好几个术语，如 “ 解耦解耦 联联 ”、“ 代谢能溢出代谢能溢出 ” 等就是用来说明等就是用来说明 这种灵活性的。这种灵活性的。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 46 实际上，曾有人这样描述过细实际上，曾有人这样描述过细 菌的这种行为：菌的这种行为：“ 可以推断，细菌可以推断，细菌 对于代谢能过剩的解决办法是把它对于代谢能过剩的解决办法是把它 浪费（用

39、）掉浪费（用）掉 ”。然而，对特定条。然而，对特定条 件下（如与不生长发生耦合或耦合件下（如与不生长发生耦合或耦合 欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢 能耗散的机制，尚待进行深入的研能耗散的机制，尚待进行深入的研 究。究。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 47 在细菌中存在很多能够浪费代在细菌中存在很多能够浪费代 谢能的反应和反应组合。如谢能的反应和反应组合。如 K+ 离离 子或子或 NH4+ 的无效循环，（在某些的无效循环，（在某些 情况下也会发生）质子的无效循环。情况下也会发生）质子的无效循环。 这样的代谢能溢出反应表明，这样的代谢能溢出反应表明，合成合

40、成 代谢与分解代谢之间存在不平衡代谢与分解代谢之间存在不平衡, 而这正是氨基酸生产菌种所希望得而这正是氨基酸生产菌种所希望得 到满足的条件。到满足的条件。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 48 其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨 酸生产的能量溢出问题已有过争论，酸生产的能量溢出问题已有过争论， 赖氨酸生产的最大转化率可能受到过赖氨酸生产的最大转化率可能受到过 量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的 高度增加使代谢发生改变，引起代谢高度增加使代谢发生改变，引起代谢 能的过剩。因此，可以认为能的过剩。因此，可以认为高的能量高的能量 耗散能力

41、适合于代谢中间产物（如氨耗散能力适合于代谢中间产物（如氨 基酸）的过量合成基酸）的过量合成。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 49 （5）有关渗透适应性问题：）有关渗透适应性问题： 在分批培养的条件下，醪液中溶在分批培养的条件下，醪液中溶 质（碳源和能源）的浓度会发生很大质（碳源和能源）的浓度会发生很大 的变化，那么了解和控制有关渗透适的变化，那么了解和控制有关渗透适 应性的代谢过程显然就相当重要了。应性的代谢过程显然就相当重要了。 细胞外部渗透压（实际上是水活度）细胞外部渗透压（实际上是水活度） 的改变不但对细胞的代谢，而且对基的改变不但对细胞的代谢，而且对基 质的吸收、产物的释放

42、都会产生有效质的吸收、产物的释放都会产生有效 的影响。的影响。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 50 关于真细菌这方面的基本机制的关于真细菌这方面的基本机制的 研究，可能促使我们去选育已丧失以研究，可能促使我们去选育已丧失以 下两种能力的菌株：下两种能力的菌株： 一是丧失对不利于生产的渗透保一是丧失对不利于生产的渗透保 护物质（如海藻糖）的合成能力；二护物质（如海藻糖）的合成能力；二 是丧失对代谢和输送反应做出渗透压是丧失对代谢和输送反应做出渗透压 响应的能力。响应的能力。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 51 2. 氨基酸生物合成的代谢流量分析氨基酸生物合成的代谢流量分析

43、 除了代谢途径及其调节机制和除了代谢途径及其调节机制和 已知途径的化学计量分析以外，稳已知途径的化学计量分析以外，稳 态代谢流量和流量动力学分析对于态代谢流量和流量动力学分析对于 理解氨基酸生产的代谢网络也越来理解氨基酸生产的代谢网络也越来 越重要。越重要。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 52 这既涉及到提供碳架物质这既涉及到提供碳架物质、 氧氧 化还原当量和代谢能的中心代谢途化还原当量和代谢能的中心代谢途 径，也涉及到那些通往特定氨基酸径，也涉及到那些通往特定氨基酸 的合成代谢途径。代谢流量分析和的合成代谢途径。代谢流量分析和 代谢流的动力学分析的一个主要目代谢流的动力学分析的一

44、个主要目 的在于鉴定代谢网络中所一般认为的在于鉴定代谢网络中所一般认为 的限速步骤。的限速步骤。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 53 CO2 NADP+NADPH+ NADP+NADPH+ 6-P-G F-6-P FDP DHAPGA-3-P 1,3-2P-GA 3-P-GA 2-P-GA PEP PYR AcCoA CTA SCA OAA ICA -KG ScCoA FMA MLAGOA Glc G6P 6-P-GARu-5-P X-5-PR-5-P E-4-P Sed-7-P PRPP UMP CTP dTMP AMP GMP DNA,RNA ATP PR-ATP PR-AMP

45、 BBM BBM IGP PRAIC IAP HP HOL HisI Glu -KG H2O Pi HAL NAD+ NAHD+ NAD+ NAHD+ Gln Glu Glu -KG NADPH+NH3 ATP ADP ADP ATP NADPH+ NADP+ Pi ATP ADP NAD+ Asp Glu Arg Pro CHO Trp PRPP PPi Ser Glu PREBTyr Phe Glu Glu SerCys S2- SO42- Ala Glu GOA Gly AMP GMP PRPP Fig. Metabolic Pathyways for the Biosynthesis

46、of Amino Acids FADH2 NADH+ GTP CO2 NADH+ NADH+ CO2 HisE DAHP Glc PEPPYR ASA ATP ADP Asp-P NADPH+ NADP+ DDP NADPH+ NADP+ Hse Thr IleMetLysIDAPH4D SCAGlu -KG NADPH+NH3 SCACO2 LysE Orn Cit Glu Asp -AL -OIVAVal Glu NADPH+NADP+ AcCoA Leu Glu H2O ppspykF ppcpck pc odc 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 54 主要可通过两种不同的方法定

47、量地、主要可通过两种不同的方法定量地、 完整地描述细胞的代谢网络：完整地描述细胞的代谢网络： （1）描述各步反应（酶）的动力学属）描述各步反应（酶）的动力学属 性及其他有用数据的方法；性及其他有用数据的方法； （2）直接测定基质、产物及一些代表）直接测定基质、产物及一些代表 性中间产物的方法，如物料平衡性中间产物的方法，如物料平衡 （ 代代 谢物平衡）技术。谢物平衡）技术。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 55 如果要对代谢网络做出完整描述并如果要对代谢网络做出完整描述并 且对各步反应及其代谢物流量的重要程且对各步反应及其代谢物流量的重要程 度做出评价，就要弄清每一个酶的的调度做出评

48、价，就要弄清每一个酶的的调 节（包括对酶的活性的调节和对表达水节（包括对酶的活性的调节和对表达水 平的调节）情况，这当然是不容易如愿平的调节）情况，这当然是不容易如愿 的，但已被实践证明，以下简化的策略的，但已被实践证明，以下简化的策略 也可以用来对代谢流进行定量的描述。也可以用来对代谢流进行定量的描述。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 56 第一种方法，在某些场合下用代谢第一种方法，在某些场合下用代谢 控制理论来对有关生物技术学的研究进控制理论来对有关生物技术学的研究进 行反应动力学的分析。其基本原理就是行反应动力学的分析。其基本原理就是 分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢分析酶活

49、力或酶浓度的微量变化对代谢 流量及代谢物浓度的影响，进而确定特流量及代谢物浓度的影响，进而确定特 定的流量控制系数定的流量控制系数 （ flux control coefficients ），），该系数反映特定反应对该系数反映特定反应对 复杂途径的影响程度。另一种更常用的复杂途径的影响程度。另一种更常用的 理论是生化系统理论（略）。理论是生化系统理论（略）。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 57 第二种方法，代谢物平衡技术。第二种方法，代谢物平衡技术。 其模式的推导建立在对基质、产物及其模式的推导建立在对基质、产物及 某些重要中间产物的直接测定上。这某些重要中间产物的直接测定上。这

50、种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖 氨酸的研究中得到了应用。如果所研氨酸的研究中得到了应用。如果所研 究的代谢网络的途径结构已知，又假究的代谢网络的途径结构已知，又假 定进行稳态代谢，那么就可通过准确定进行稳态代谢，那么就可通过准确 测得的所有进出细胞代谢流的流量，测得的所有进出细胞代谢流的流量， 推导出特定途径的代谢流量分布。推导出特定途径的代谢流量分布。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 58 但用这类方法计算，很难把代谢但用这类方法计算，很难把代谢 环路（环路（ 如如TCA环环 ）、重要节点（）、重要节点（ 如如 PYR、 PEP 节点节点 ） 、以

51、及平衡反应、以及平衡反应 （酶促反应的正向和逆向流量）的特（酶促反应的正向和逆向流量）的特 殊重要性包罗在内。这是这类方法的殊重要性包罗在内。这是这类方法的 局限性。为了弥补这种局限性，近年局限性。为了弥补这种局限性，近年 已有几种技术用到这种类型的分析中已有几种技术用到这种类型的分析中 去了。去了。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 59 如采用示踪流量实验（如采用示踪流量实验（tracer flux experiments ）技术、快速取技术、快速取 样技术及核磁共振（样技术及核磁共振（NMR）技术技术 可获得关于代谢流分布的另外一可获得关于代谢流分布的另外一 些信息，些信息， 如

52、代谢网络的有关组成如代谢网络的有关组成 部分中的流量分布、部分中的流量分布、 胞内不同代胞内不同代 谢产物的累积量，谢产物的累积量， 以及它们各自以及它们各自 随时间而变化的情况。随时间而变化的情况。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 60 有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长 期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷 氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内 代谢流的不同分布情况（代谢流的不同分布情况（ 下图），它们下图），它们 以以13C 标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，标记的葡萄糖为碳源进

53、行分批发酵， 然后运用然后运用 NMR 测定标记了的代谢物，同测定标记了的代谢物，同 时运用质量平衡法进行计算，得到了图中时运用质量平衡法进行计算，得到了图中 的流量分布图，或称的流量分布图，或称代谢断面代谢断面 （ sections of the metabolism ）图图。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 61 Glu G6P F6P GA3P PYR R5P CO2 OAACO2 GOA Biomass HMP TCA CO2回补 EMP 100 59 40 7 33 85 21 7 1 35 18 10 (60) 14 1 54 36 13 3 A. 对数生长期 Glu G

54、6P F6P GA3P PYR R5P CO2 OAA CO2 GOA Biomass HMP TCA CO2回补 EMP 100 52 47 8 39 89 8 2 1 34 18 16 (80) 6 1 53 35 21 5 Lys CO2 12 16 24 4 B. 赖氨酸生成期 Glu G6P F6P GA3P PYR R5P CO2 OAACO2 GOA Biomass HMP TCA CO2回补 EMP 100 83 17 3 14 97 0 0 0 32 21 33 (25) 0 1 64 43 44 11 C. 谷氨酸生成期 Glu 55 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座

55、） 62 由图可见，在不同条件下，由图可见，在不同条件下， 流量发生了显著的变化。酵解途径流量发生了显著的变化。酵解途径 的的 HMP 旁路的流量分布在赖氨酸旁路的流量分布在赖氨酸 生成时增加，而在谷氨酸生成时则生成时增加，而在谷氨酸生成时则 下降。在氨基酸分泌的情况下，回下降。在氨基酸分泌的情况下，回 补反应变得更重要一些。补反应变得更重要一些。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 63 另一个长期以来不能确定的另一个长期以来不能确定的 问题也在研究中得到了解决，也问题也在研究中得到了解决，也 就是氨基酸生成条件下就是氨基酸生成条件下 GOA 环环 活力的问题，在氨基酸生成条件活力的问

56、题，在氨基酸生成条件 下，下， GOA 环的活力实测是非常环的活力实测是非常 低的。低的。 下图为在下图为在不同转化率时的理不同转化率时的理 论流量分布图论流量分布图。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 64 G6P F6P PEP PYR AcCoA Ru5P Glc CO2 OAA Lys 100 15 11 83 79 8 2 100 5 15 30 33 17 3 3 115 85 20 A. 平衡生长 G6P F6P PEP PYR AcCoA Ru5P Glc CO2 OAA Lys 100 6 94 99 10063 35 128 128 35 B. YLys/Glc=3

57、5% G6P F6P PEP PYR AcCoA Ru5P Glc CO2 OAA Lys 100 150 -50 75 100-25 75 0 0 75 C. YLys/Glc=75% CO2CO2CO2 5 125 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 65 课外学习参考资料：课外学习参考资料： Metabolic Pathway Synthesis (p288) Metabolic Flux Analysis (p309) in Metabolic Engineering, 1998 Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic

58、 Engineering, 1999 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 66 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出 基质的吸收和产物的输出对于氨基基质的吸收和产物的输出对于氨基 酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，酸的生成是非常重要的。对于某些细菌， 特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制 已作了详尽的研究，但对于其它生物工已作了详尽的研究，但对于其它生物工 程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗 糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关 于产物氨基酸怎样跨过膜而被

59、分泌出细于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细 胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 67 近年的研究表明，在氨基酸生产近年的研究表明，在氨基酸生产 的条件下，的条件下， “ 氨基酸被动扩散跨过氨基酸被动扩散跨过 细胞质膜细胞质膜 ” 这一设想是武断的。谷这一设想是武断的。谷 氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、 异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中 谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的 输送过程，而且不纯粹是被动的。而输送过程，而且不纯

60、粹是被动的。而 运动发酵单胞菌（运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis） 的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单 扩散机制来分泌。扩散机制来分泌。 2021-8-8张星元：发酵原理（讲座） 68 详细了解特定氨基酸跨过细胞质详细了解特定氨基酸跨过细胞质 膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过 程的效率和转化率也非常重要。尽管程的效率和转化率也非常重要。尽管 采用细菌来生产氨基酸往往可以获得采用细菌来生产氨基酸往往可以获得 极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未 意识到这至少部分是由于细胞向载体意识到这至少