第七章_固定化酶 to 学生

1、1 第七章第七章 固定化酶固定化酶 2 酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足 v酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和淀粉酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的胃蛋白酶等可以耐受较低的pHpH条件以外，大多数的酶在高温、条件以外，大多数的酶在高温、 强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失 活。活。 v酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶 在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使在反应系统中，与底

2、物和产物混在一起，反应结束后，即使 酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的 方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 v产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，：酶反应后成为杂质与产物混在一起， 无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 固定化技术固定化技术 3 什么是固定化酶？什么是固定化酶？ 水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体 水不溶性酶水不溶性酶 （固定化酶）（固定化酶） 固定化技术固

3、定化技术 v在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进 行反应，反应后的酶可以回收重复利用。行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 4 固定化酶的优点：固定化酶的优点： v酶与产物、底物易分开；酶与产物、底物易分开； v可多批次使用和装柱连续反应；可多批次使用和装柱连续反应； v提高酶的稳定性；提高酶的稳定性； v产物中无酶残留，简化产品纯化工艺；产物中无酶残留，简化产品纯化工艺； v提高酶的使用效率，成本降低；提高酶的使用效率，成本降低； v增加产物收率，提高产物质量。增加产物收率，提高产物质量。 5 v缺点：缺点： v酶活力损失；酶活力损失； v增加了酶的成

4、本；增加了酶的成本； v只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底 物，对大分子不适宜；物，对大分子不适宜； v不适宜于多酶反应。不适宜于多酶反应。 6 选择载体选择载体 应考虑：应考虑： v载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗粒载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗粒 状等；状等； v载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型；载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型； v载体的性质：水溶性和水不溶性；载体的性质：水溶性和水不溶性； v酶偶联量或装载量和实效系数。酶偶联量或装载量和实效系数。 v无机（无机（inorganicinorganic） v天然有机（天然有机（org

5、anic from natural sources)organic from natural sources) v合成有机（合成有机（organic synthetic materials)organic synthetic materials) 7 酶固定化时遵循的原则：酶固定化时遵循的原则： v维持酶的催化活性和专一性；维持酶的催化活性和专一性； v固定化应有利于自动化、连续化反应；固定化应有利于自动化、连续化反应； v固定化酶应具有最小的空间位阻；固定化酶应具有最小的空间位阻； v酶与载体必须牢固结合；酶与载体必须牢固结合； v固定化酶应具有最大的稳定性；固定化酶应具有最大的稳定性； v

6、固定化酶易与产物分离；固定化酶易与产物分离； v固定化酶成本要低；固定化酶成本要低； v充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。 8 酶的固定化方法酶的固定化方法 v1 1 非化学结合法：非化学结合法： 结晶法、分散法、物理吸结晶法、分散法、物理吸 附法、离子结合法；附法、离子结合法； v2 2 化学结合法：交联法、共价结合法；化学结合法：交联法、共价结合法； v3 3 包埋法：微囊法、网格法。包埋法：微囊法、网格法。 9 非化学结合法非化学结合法 v结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。 v分散法：将酶

7、分散于水不溶相中而实现固定。分散法：将酶分散于水不溶相中而实现固定。 v超滤反应体系超滤反应体系 v离子结合：酶通过离子键结合具有离子交换离子结合：酶通过离子键结合具有离子交换 基的水不溶性载体的固定化方法。基的水不溶性载体的固定化方法。常用载常用载 体体: :DEAE-DEAE-纤维素，纤维素， DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶等。使用使用 注意注意：pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度 10 吸附法：物理吸附、离子交换吸附法：物理吸附、离子交换 v吸附：吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在 其表面上而实现每固定化的方法。其表面上

8、而实现每固定化的方法。 v常用的常用的固体吸附剂固体吸附剂： v无机载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、无机载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、 多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、白土、漂白土、高多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、白土、漂白土、高 岭石、氧化铝、金属氧化物。岭石、氧化铝、金属氧化物。 v天然及合成高分子载体：淀粉、天然及合成高分子载体：淀粉、CMCCMC、DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、 大孔树脂大孔树脂 v非共价作用力非共价作用力，如静电、范德华力、离子键和氢键，如静电、范德华力、离子键和氢键 等。等。 11 物理吸附 v通过氢键、疏水键、电子亲和力等物理作用通过氢键、疏水键

9、、电子亲和力等物理作用 v选择载体的原则选择载体的原则 v（1 1）要有巨大的比表面积）要有巨大的比表面积 v（2 2） 要有活泼的表面要有活泼的表面 v（3 3） 便于装柱进行连续反应。便于装柱进行连续反应。 v缺点：缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而结合力较弱，酶与载体结合不牢固而 容易脱落，所以使用受到一定的限制容易脱落，所以使用受到一定的限制 12 离子键结合法 v通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 v使用的使用的载体载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的是某些不溶于水的离子交换剂。常用的 有有DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、TEAE-

10、TEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 等等 。 v固定化方法固定化方法：条件温和，操作简单，在一定：条件温和，操作简单，在一定pHpH，T T、 离子强度下，酶液与载体混合搅拌几个小时离子强度下，酶液与载体混合搅拌几个小时/ /酶液酶液 流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。 v应用：应用：制备过程中，活力损失较少。但是，离子键制备过程中，活力损失较少。但是，离子键 结合力较弱，结合不牢固，在结合力较弱，结合不牢固，在pHpH和离子强度等条件和离子强度等条件 改变时，酶容易脱落。在酶催化反应时，要控制好改变时，酶容易脱落。在酶

11、催化反应时，要控制好 pHpH、离子强度和温度等条件。、离子强度和温度等条件。 13 吸附吸附 法法 原理原理载体载体优缺点优缺点 物理物理 吸附吸附 通过氢键、疏水键通过氢键、疏水键 和和- -电子亲和力等电子亲和力等 物理作用力将酶固物理作用力将酶固 定于水不溶性载体定于水不溶性载体 无无 机机 载载 体体 高岭土、皂土、高岭土、皂土、 硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝、 微孔玻璃微孔玻璃 吸附量较低，多为吸附量较低，多为1mg1mg 蛋白蛋白/ /每克吸附剂；易每克吸附剂；易 使某些酶发生吸附变使某些酶发生吸附变 性性 有有 机机 载载 体体 纤维素、胶原、纤维素、胶原、 以及火棉胶以及火棉胶

12、 吸附容量高，通常高吸附容量高，通常高 于于50mg50mg蛋白质蛋白质/ /每克胶每克胶 原膜；不易使酶发生原膜；不易使酶发生 变性变性 离子离子 交换交换 吸附吸附 在适宜的在适宜的PHPH和离子和离子 强度条件下，利用强度条件下，利用 酶的侧链解离基团酶的侧链解离基团 和离子交换基团的和离子交换基团的 相互作用而达到酶相互作用而达到酶 的固定化的固定化 CM-CM-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-纤纤 维素、维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝葡聚糖凝 胶、胶、Amberlitex-97Amberlitex-97、 Dowex-50Dowex-50 吸附容量大于物理吸吸附容量大于物理吸

13、 附，约附，约50-150mg50-150mg蛋白蛋白/ / 每克载体每克载体 物理吸附和离子交换吸附的比较物理吸附和离子交换吸附的比较 14 v吸附法的优点吸附法的优点 v不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。 v固定化操作简单，条件温和，固定化操作简单，条件温和， v容易再生，吸附剂可反复使用。容易再生，吸附剂可反复使用。 v缺点：缺点： v作用力弱，容易泄漏，污染产物，作用力弱，容易泄漏，污染产物， v载体非专一性结合其他物质载体非专一性结合其他物质 v被吸附的酶要过量，酶损耗大被吸附的酶要过量，酶损耗大 解决途径：解决途径： 开发新的载体开

14、发新的载体 根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸附力根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸附力 15 包埋法（包埋法（entrapping methodentrapping method） v定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体 中，使酶固定化的方法称为包埋法。中，使酶固定化的方法称为包埋法。 v包埋法分为网格型和微囊型包埋法分为网格型和微囊型 v1 1网格型网格型 v2 2微囊型微囊型 16 网格型网格型 v概念概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制 成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。

15、成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称也称 为凝胶包埋法为凝胶包埋法 p包埋剂：较好的机械强度、半透性、惰性、不与酶发包埋剂：较好的机械强度、半透性、惰性、不与酶发 生物理化学变化、包埋后酶活性丧失少等。生物理化学变化、包埋后酶活性丧失少等。 p固定微生物细胞最为广泛，多酶体系的包埋。固定微生物细胞最为广泛，多酶体系的包埋。 p高分子化合物：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、高分子化合物：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、 p天然高分子：淀粉、明胶、海藻酸等。天然高分子：淀粉、明胶、海藻酸等。 17 微囊型包埋法微囊型包埋法 v酶包埋在各种高分子聚合物半透膜中制成的小球，酶包埋在各种高分子聚合物半透膜中制成

16、的小球， 制成固定化酶。制成固定化酶。 v形成的固定化酶小球直径一般几微米至几百微米，形成的固定化酶小球直径一般几微米至几百微米， 所以也称为微囊化法。所以也称为微囊化法。 v半透膜的孔径半透膜的孔径0.5-10nm0.5-10nm。颗粒比网格型小，有利。颗粒比网格型小，有利 于底物和产物扩散。于底物和产物扩散。 v反应条件要求高，反应条件要求高， 成本高成本高 v半透膜材料半透膜材料：聚酰：聚酰 胺、火棉胶、硝化胺、火棉胶、硝化 纤维、聚苯乙烯、纤维、聚苯乙烯、 壳聚糖等。壳聚糖等。 18 化学结合法化学结合法 v共价键结合法共价键结合法 v交联法交联法 19 共价键结合法共价键结合法 v（

17、1 1）概念：概念：通过共价键将酶蛋白分子上的反应基通过共价键将酶蛋白分子上的反应基 团与载体表面反应基团结合，从而使酶固定化的方团与载体表面反应基团结合，从而使酶固定化的方 法。法。 v（2 2）可以形成共价键的基团可以形成共价键的基团： 游离氨基，游离氨基， 游离游离 羧基，羧基， 巯基，巯基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羟基，羟基， 甲硫基，甲硫基， 吲哚基，二硫键吲哚基，二硫键 v（3 3）常用载体常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、：天然高分子、人工合成的高聚物、 无机载体，如：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、无机载体，如：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、 甲壳质、氨基酸共

18、聚物、甲基丙稀醇共聚物甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物 20 共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式” v1.1.首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 v2.2.然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 v 3.3.最后最后, ,活泼基团再与酶分子上某一基团形成活泼基团再与酶分子上某一基团形成 共价键共价键 21 载体活化的方法载体活化的方法 vA A重氮法重氮法 vB B叠氮法叠氮法 vC C烷基化反应法烷基化反应法 vD D硅烷化法硅烷化法 vE E溴化氰法溴化氰法 22 A重氮法重氮法 v使用较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（使用较多的载体是对氨基苯磺酰乙基

19、（ABSEABSE）纤维）纤维 素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等 v载体具有芳香族氨基载体具有芳香族氨基，苯氨基与亚硝酸生成重氮盐，苯氨基与亚硝酸生成重氮盐 衍生物，引入活泼的衍生物，引入活泼的重氮基团重氮基团。 v重氮基团与重氮基团与酶分子的酚基、咪唑基酶分子的酚基、咪唑基发生发生偶联偶联。 23 B B 叠氮法叠氮法 v羧基的载体羧基的载体，酯化酯化，与，与肼基肼基作用生成含有酰肼基团的载体，作用生成含有酰肼基团的载体， 再与亚硝酸再与亚硝酸活化活化，生成活泼的，生成活泼的叠氮化合物叠氮化合物，最后于酶，最后于酶偶联。偶联。 v叠氮基团与叠氮基团与酶分子的氨基、

20、羟基、巯基酶分子的氨基、羟基、巯基反应，固定化酶。反应，固定化酶。 如如CM-CM-纤维素、纤维素、 葡聚糖、聚氨基葡聚糖、聚氨基 酸、乙烯酸、乙烯- -顺丁顺丁 烯二酸酐共聚等烯二酸酐共聚等 24 C C烷基化反应法烷基化反应法 v首先，首先，含羟基的载体含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行可用三氯三嗪等多卤代物进行 活化活化，形成含有卤素基团的活泼载体。，形成含有卤素基团的活泼载体。 v然后，与然后，与酶分子的氨基、巯基、羟基酶分子的氨基、巯基、羟基烷基化反应烷基化反应偶偶 联联固定化酶固定化酶. . 25 D D 溴化氰法溴化氰法 v用用溴化氰溴化氰（CNBrCNBr）活化多糖类物质。

21、）活化多糖类物质。 v载体：载体：如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为 载体的占多数（大孔网状结构）。载体的占多数（大孔网状结构）。 v用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很 广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 26 E硅烷化法 v一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。 v多孔玻璃特点：多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。机械强度好，表面积大。 v耐有机溶剂和微生物破坏耐有机溶剂和微生物破坏, ,载体再生，寿命长。

22、载体再生，寿命长。 27 v共价结合法优点：共价结合法优点： v结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连 续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱 落，应用和报道最多的一种方法。落，应用和报道最多的一种方法。 v缺点：缺点： v反应条件苛刻，操作复杂，反应条件苛刻，操作复杂， v引起高级结构变化，破环活性中心，不易引起高级结构变化，破环活性中心，不易 得到比活力高的固定化酶，酶活回收率得到比活力高的固定化酶，酶活回收率30%30%， v底物专一性会发生变化。底物专一性会发生变化。 28 交联法交联法 v借助借助双功能试剂双功能试剂

23、使酶分子之间发生使酶分子之间发生交联交联作用，作用， 制成制成网状结构网状结构的固定化酶的方法称为交联法。的固定化酶的方法称为交联法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 29 交联法常用试剂交联法常用试剂 v常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N N，NN乙烯马来亚胺、乙烯马来亚胺、 双重氮联苯胺等。双重氮联苯胺等。 v应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白 质的游离氨基形成席夫碱质的游离氨基形成席夫碱(shiff(shiff) )，而交联成固定化酶，而交联成固定化酶 30 v

24、交联法固定化酶的特点交联法固定化酶的特点: : 结合牢固，可长时间使用结合牢固，可长时间使用 交联反应条件较剧烈，酶分子多个基团被交联，交联反应条件较剧烈，酶分子多个基团被交联， 酶活力损失较大酶活力损失较大 颗粒较小，使用不便。颗粒较小，使用不便。 p通常交联、吸附法或包埋法联合使用，取长补短通常交联、吸附法或包埋法联合使用，取长补短。 （1 1） 吸附交联法吸附交联法 （2 2） 交联包埋法交联包埋法 31 v吸附交联法：吸附交联法： 酶先吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树酶先吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树 脂或大孔离子交换树脂，脂或大孔离子交换树脂， 再用戊二醛等双功能试剂交联，

25、也称壳状固定再用戊二醛等双功能试剂交联，也称壳状固定 化酶。化酶。 v交联包埋法：交联包埋法： 1st step:1st step:酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成 颗粒很细的聚合体。颗粒很细的聚合体。 2nd step2nd step：高分子或多糖类物质包埋成颗粒。：高分子或多糖类物质包埋成颗粒。 避免颗粒太细的缺点，固定化酶稳定性好。避免颗粒太细的缺点，固定化酶稳定性好。 32 方法方法优点优点缺点缺点 非非 化化 学学 结结 合合 法法 结晶结晶 法法 提供非常高的酶浓度，对于活力较低提供非常高的酶浓度，对于活力较低 的酶来说具有很大的优越性；应用时的酶来

26、说具有很大的优越性；应用时 可大大缩短反应时间可大大缩短反应时间 在不断重复循环中，酶会有损耗，在不断重复循环中，酶会有损耗， 从而使固定化酶浓度降低从而使固定化酶浓度降低 分散分散 法法 通过过滤或离心法将酶与介质完全分通过过滤或离心法将酶与介质完全分 离，进而实现酶的再利用离，进而实现酶的再利用 酶分散不好将会引起传质效应，酶分散不好将会引起传质效应， 使酶的催化活力降低。使酶的催化活力降低。 物理物理 吸附吸附 法法 活性中心不易被破坏，高级结构变化活性中心不易被破坏，高级结构变化 少，操作方便，条件温和，载体价廉少，操作方便，条件温和，载体价廉 易得、可反复使用等。易得、可反复使用等。

27、 酶与载体结合力弱，酶容易脱落。酶与载体结合力弱，酶容易脱落。 离子离子 结合结合 法法 操作简单、处理条件温和、酶活性中操作简单、处理条件温和、酶活性中 心氨基酸残基和酶高级结构不易被破心氨基酸残基和酶高级结构不易被破 坏，酶的回收率高坏，酶的回收率高 酶与载体结合力弱，容易受缓冲酶与载体结合力弱，容易受缓冲 液或液或pHpH的影响，离子强度高时酶的影响，离子强度高时酶 易脱落易脱落 化化 学学 结结 合合 法法 共价共价 结合结合 法法 酶与载体结合牢固，不会因底物浓度酶与载体结合牢固，不会因底物浓度 高或存在盐而脱落高或存在盐而脱落 反应条件苛刻、操作复杂；活性反应条件苛刻、操作复杂；活

28、性 中心、酶高级结构和酶专一性易中心、酶高级结构和酶专一性易 受破坏受破坏 交联交联 法法 比较牢固，可长时间使用比较牢固，可长时间使用反应条件激烈，酶多个基团被交反应条件激烈，酶多个基团被交 联，活力损失大，颗粒小联，活力损失大，颗粒小 包埋法包埋法 不与酶蛋白氨基酸残基结合，很少改不与酶蛋白氨基酸残基结合，很少改 变酶结构，酶活回收率高变酶结构，酶活回收率高 包埋时化学聚合反应，易导致失包埋时化学聚合反应，易导致失 活，只适用于小分子底物和产物活，只适用于小分子底物和产物 体系体系 33 固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项 v活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中：保

29、护酶的催化作用，并使酶的活性中 心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在 制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 v功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯 基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和 苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性 中心时，要求不参与酶的固定化结合中心时，要求不参与酶的固定化结合 v酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处：要避免用

30、高温、强酸、强碱等处 理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、 失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进 行。行。 34 固定化酶的性质及其影响因素 v影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 v固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化 v评价固定化酶的指标评价固定化酶的指标 35 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 v1.1.酶本身的变化酶本身的变化， 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等 发生了变化。发生了变化。 v2 2

31、固定化方法的影响固定化方法的影响 v3.3.载体的影响载体的影响 固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层，以固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层，以 及静电的相互作用等引起的变化。及静电的相互作用等引起的变化。 （1 1） 分配效应分配效应 （2 2） 空间障碍效应空间障碍效应 （3 3） 扩散限制效应扩散限制效应 v4.载体与酶直接作用：载体与酶直接作用： 活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位 36 固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化 v固定化对酶活性的影响固定化对酶活性的影响： v固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响

32、vpHpH的变化的变化 v最适温度变化最适温度变化 v底物特异性变化底物特异性变化 v米氏常数米氏常数KmKm的变化，的变化，KmKm值随载体性质变化值随载体性质变化 37 1 1 固定化对酶活性的影响固定化对酶活性的影响 v酶活性下降，反应速度下降酶活性下降，反应速度下降 v原因：原因： 酶结构的变化、构象变化，影响活性中心氨基酸酶结构的变化、构象变化，影响活性中心氨基酸 空间位阻：活性中心对底物的定位空间位阻：活性中心对底物的定位 内扩散阻力：底物与活性中心的接近内扩散阻力：底物与活性中心的接近 包埋时被高分子物质半透膜包围，大分子底物难以包埋时被高分子物质半透膜包围，大分子底物难以 进去

33、。进去。 p个别情况：酶活提高，化学偶联使得到化学修饰。个别情况：酶活提高，化学偶联使得到化学修饰。 38 2 2 固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响 v（1 1）操作稳定性提高）操作稳定性提高 v（2 2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。）贮存稳定性比游离酶大多数提高。 v (3)(3)热稳定性，大多数升高，有些反而降低。热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 v (4(4）对分解酶的稳定性提高。）对分解酶的稳定性提高。 v（5）pH稳定性提高，明显优于游离酶稳定性提高，明显优于游离酶 v（6）对有机溶剂的稳定性提高）对有机溶剂的稳定性提高 p稳定性提高的原因：稳定性提高的原因： 39

34、 固定化后酶稳定性提高的原因：固定化后酶稳定性提高的原因： v酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形，酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形， 增加了酶活性构象的牢固程度增加了酶活性构象的牢固程度 v酶活力的释放是缓慢的。酶活力的释放是缓慢的。 v酶与载体结合后，失去了分子间的相互作用的机酶与载体结合后，失去了分子间的相互作用的机 会，抑制了酶自降解会，抑制了酶自降解，提高了酶稳定性。，提高了酶稳定性。 v阻挡了不利因素对酶的侵袭阻挡了不利因素对酶的侵袭 v限制了酶分子间的相互作用，但若固定化触及到限制了酶分子间的相互作用，但若固定化触及到 酶的活性敏感区，也可能导致酶的稳定性下降。酶的活

35、性敏感区，也可能导致酶的稳定性下降。 40 pH的变化 vpHpH对酶活性的影响：对酶活性的影响： v（1 1） 改变酶的空间构象改变酶的空间构象 v（2 2）影响酶的催化基团的解离）影响酶的催化基团的解离 v（3 3）影响酶的结合基团的解离）影响酶的结合基团的解离 v（4 4）改变底物的解离状态，酶与底物）改变底物的解离状态，酶与底物 不能结合或结合后不能生成产物。不能结合或结合后不能生成产物。 41 pH对固定化酶的影响 v载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。 v载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。 v微环境微环境是指在固定化

36、是指在固定化 酶附近的局部环境，酶附近的局部环境， v而把主体溶液称为而把主体溶液称为宏宏 观环境。观环境。 42 v最适温度变化最适温度变化 随热稳定性的提高，最适温度随之提高随热稳定性的提高，最适温度随之提高 少数例外，最适温度下降，活性或其他因素会改善少数例外，最适温度下降，活性或其他因素会改善 v底物特异性变化底物特异性变化 专一性会发生不同程度的变化专一性会发生不同程度的变化 作用于小分子底物的酶：特异性没有明显变化作用于小分子底物的酶：特异性没有明显变化 既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶：既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶： 特异性往往会变化。特异性往往会变化

37、。 43 米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体性质变化值随载体性质变化 v米氏常数反映酶与底物的亲合力：米氏常数反映酶与底物的亲合力： KmKm升高，酶与底物的亲和力降低升高，酶与底物的亲和力降低 v载体的带电性能影响载体的带电性能影响KmKm变化变化( (电中性载体，扩散限制使电中性载体，扩散限制使 表观表观KmKm上升上升) )。 带电载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和带电载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和 整个溶液之间不均一分布：整个溶液之间不均一分布： （1 1） 载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，KmKm KmKm 固定化酶降低了酶的

38、亲和力。固定化酶降低了酶的亲和力。 （2 2） 载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反，静电作用，KmKmKmKm 44 评价固定化酶的指标： v1. 1. 固定化酶的比活：固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有每（克）干固定化酶所具有 的酶活力单位。或：单位面积（的酶活力单位。或：单位面积（cmcm2 2）的酶活力单位）的酶活力单位 表示（酶膜、酶管、酶板）。表示（酶膜、酶管、酶板）。 v2. 2. 操作半衰期：操作半衰期：衡量稳定性的指标。衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一 半所需要的时间（半所需要的时间（t

39、 t1/2 1/2） ） 45 v3. 酶结合效率酶结合效率 v4. 4. 酶活力回收率酶活力回收率（或称偶联效率，活力保留百分数）（或称偶联效率，活力保留百分数） 46 四 固定化酶的活力测定方法介绍 v1. 振荡测定法：振荡测定法：称取一定量的固定化酶称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物加入一定量的底物 溶液，溶液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量取出一定量 的反应液进行酶活力测定。的反应液进行酶活力测定。 v2. 酶柱测定法：酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱 中中 让底物溶液以

40、一定的流速流过酶柱让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应收集流出的反应 液液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量测定其中产物的生成量或底物的消耗量 v3. 3. 连续测定法：连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固利用连续分光光度法等测定方法可以对固 定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。 47 固定化细胞 v固定在载体上并在一定的空间范围内进行固定在载体上并在一定的空间范围内进行 生命活动的细胞称为固定化细胞生命活动的细胞称为固定化细胞. v该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈

41、代 谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 48 固定化细胞的特点 v保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好 v保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，保证了细保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，保证了细 胞的代谢途径和代谢调控胞的代谢途径和代谢调控 v发酵稳定性好，可反复使用；发酵稳定性好，可反复使用； v固定化细胞密度提高，可以提高产率；固定化细胞密度提高，可以提高产率； v提高了工程菌的质粒稳定性提高了工程菌的质粒稳定性 49 细胞固定化方法 v吸附法 v包埋法 v吸附法吸附法 v它主要通

42、过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面 与载体之间范德华作用力、离子键和氢键作用力，与载体之间范德华作用力、离子键和氢键作用力， 才使细胞固定在载体上的。才使细胞固定在载体上的。 50 影响吸附法的主要因素 v（1）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞 壁的电荷性质壁的电荷性质 v（2）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等 无机材料无机材料 51 包埋固定法 v概念：概念：细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合，包细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合，包 埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内。埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内。 v最大优点：最大优点：能较好的保持细胞内多酶系统的活力，能较好的保持细胞内多酶系统的活力， 像游离细胞，