染色体标本的制作及组型观察

1、染色体标本的制备及组型观察【实验目的】1. 掌握染色体标本制作的基本方法；2. 认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。 【制作染色体标本的意义】 了解染色体的特征（形态、大小、数目）绘制染色体组型图 【染色体组型图的应用】 生物学方面： 根据染色体特征鉴别生物及种类：兔 44 条；小鼠 40 条；大鼠 42条；鸡 78条；猫 38条；狗 78 条；人 46 条；马 64条 临床医学方面 ：主要用于遗传性疾病的诊断和研究：21 三体综合症： 是 21 对常染色体多一条，此种人“先天愚型”，或称“伸 舌样白痴”卵巢退化症： 45 XO，外貌表现为女性，卵巢发育不全或无，米以下，不能 生育

2、。睾丸退化症： 47 XXY ，外貌为男性，比一般男性高，睾丸发育不全，有女 性样乳房，智力低下或超常，不能生育，发声尖高。因此，染色组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中 （抽羊水做组型）【染色体标本制作的原理】选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠 细胞具有旺制作染色体施加药物使细胞分裂： PHA设法得到大量的分裂中期细胞：秋水仙素1. PHA：促进细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变成淋巴母细胞。2. 秋水仙素 ：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停在分裂中期。3. 空气干燥 ：使细胞与染色体展开。4. 低渗作用 ：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离变大，易于染色体分散开

3、。5. 固定： 用 Camoy s solution, 作用使蛋白变性，对染色体内的组蛋白讲，变形后硬度增加，保持 了染色体的“即时形态”对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞 内物质外溢和丢失。【实验用品】1. 实验器材： 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离 心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯2. 实验药品： 蒸馏水、 %N aCl溶液、 % KCl 溶液，固定液（甲醇：冰醋酸 =3:1 ）、 秋水仙素3. 实验材料： 小鼠实验步骤】1. 取雄性小鼠，以每克体重 4 微克注射秋水仙素（约 1mL）， 14-16h 后，用断头法处死小鼠，

4、取出 睾丸用生理盐水（ % NaCl 溶液）洗去血污，置于解剖盘中。2. 将睾丸放入装有 1mL % KCl溶液的小烧杯中剪碎（液体呈乳白色） 。3. 用铜网过滤到刻度离心管中，再加 % KCl溶液至 4mL。4. 37静置 30mins ，进行低渗处理。5. 以 800-1000r/min 离心 8 分钟。6. 弃上清液，加入 2mL 甲醇冰醋酸固定液。用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8mins。7. 再以 800-1000r/min 离心 8 分钟。8. 弃上清液，加入 1mL 甲醇冰醋酸固定液，再制成细胞悬液，固定5mins。9. 取去洁净的低温预冷载片，距载片 10-15cm 的高

5、度滴下 2-3 滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻 轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。10. 用滤纸擦去载片上的多余液体，空气干燥或文火干燥。11. 用染液染色 20 30 分钟，细水冲洗玻片背面，去除多余染液，气干。12. 镜检：低倍镜下寻找分散良好，染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。【实验结果】精子头部精子鞭毛 分裂中期的染色体 未破碎的细胞【实验结果分析】1. 显微镜下可看到蓝紫色的染色体。还有很多未破碎的细胞。因为本实验采用的 是小鼠的睾丸进行实验，所以视野中可见大量的精子，它们有一个比较圆的头 部和鞭毛。2. 我观察到的细胞处在分裂中期，

6、显微镜下大致可观察到 32 条染色体，这可能 是因为部分染色体在实验过程中丢失；分析丢失原因如下：（ 1）. 摔碎细胞时可能高度有点过高，导致细胞被摔碎后，其中的染色体也 被一同摔了出去。（ 2）. 因为染色时间过长，玻片在染液中浸泡时间太久，染色体丢失在染液 中。3. 有同学在显微镜下观察到 20 条染色体，这部分细胞为单倍体细胞，处于减数 第二次分裂中期。4. 实验结果所得到的染色体大多数棒状而不是V 型，这是因为吹气时染色体未展平好。5. 实验中观察到的大多数细胞未破碎，分析原因可能如下：（1）. 摔细胞时高度不够，细胞未完全摔碎；（2）. 在剪碎组织时没有剪好，大量细胞聚集在一起，滴片

7、时采用的高度很难摔碎；（3）. 低渗不完全，细胞膨胀不完全，很难摔碎；（4）. 敲打细胞时力度不够，导致细胞还是聚集在一起。【注意事项】1. 吹散细胞：应该轻轻地吹细胞，如果太用力会导致细胞破裂2. 铜网过滤：利用铜网进行过滤操作的时候，应尽量将组织剪碎，并且让滤液慢 慢流下，不能人为破坏铜网以加快速度。3. 剪碎组织时，应尽量将组织剪碎，若烧杯中或者过滤完铜网上还有较大块的组 织，应在烧杯中继续加入 % KCl 溶液，继续剪。4. 本实验采用倒置染色法，目的： 1). 可以节省染料； 2). 可以避免染液快速挥发； 3). 可以防止 染色颗粒沉淀，影响观察。5. 在染色时应注意， 多个样品同时染色应摆放紧密， 不要有间隙； 滴染液时应尽量慢， 不要有气泡， 以免部分染色体不被着色。6. 染色：染色之后应冲去染液并晾干，注意使用小水流并从背面冲洗，这样可以避免冲去细胞。7. 摔碎细胞：摔碎细胞时应注意滴管与载玻片的距离，如果距离太小，则细胞很难摔碎，不会观察 到染色体；但如果距离太大，会使细胞完全的碎开，染色体飞出或者染色体布满视野，给计数造 成一定难度。【实验反思】 本次试验，虽然