重组人生长激素对裸鼠胃癌移植瘤生长及血清VEGF浓度的影响

1、重组人生长激素对裸鼠胃癌移植瘤生长及血清VEGF浓度的影响 11-03-25 11:38:00 作者：程璐,林岩,李苏宜 编辑：studa20【摘要】 目的：研究重组人生长激素(rhGH)对裸鼠人胃癌移植瘤生长及血清VEGF水平的影响。方法：取60只雄性裸鼠进行实验，通过免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞株SGC7901及MKN45生长激素受体(GHR)的表达状况，将GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC7901及GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN45分别接种于4只裸鼠皮下，制作裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，3周后取出移植瘤制成组织匀浆，接种于剩余52只裸鼠。依据接种细胞种类不同分为移植瘤GHR阳性表达和GHR

2、阴性表达裸鼠，不同GHR表达的裸鼠进一步分为对照组(C组：予0.9%NaCl，0.2 mld-1)、rhGH低剂量组(L组：予rhGH 0.5 Ukg-1d-1)、rhGH高剂量组(H组：予rhGH 2.5 Ukg-1d-1)，连续给药14 d，观察并记录各组裸鼠体重和肿瘤体积变化，酶联免疫吸附法测定血清VEGF含量。结果：SGC7901为GHR阳性表达的人胃癌细胞株，MKN45为GHR阴性表达的人胃癌细胞株。对于接种GHR阳性表达的人胃癌细胞株的裸鼠，rhGH给药组皮下移植瘤体积较对照组增大(P0.05)，且H组促增长效应显著(P0.05)；血清VEGF检测，L组为（167.609.54 ）

3、 pgml-1，H组为（252.9415.32 ） pgml-1，较C组（49.945.73） pgml-1升高(P0.05)；对于接种GHR阴性表达的人胃癌细胞株的裸鼠，L组、H组体重均大于对照组(P0.05)。结论：rhGH能促进GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC7901移植瘤生长，并促进血清VEGF表达增高；对GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN45移植瘤没有表现出明显的促肿瘤生长及促血清VEGF表达效应。GHR表达情况可能是rhGH影响血清VEGF分泌的关键靶点之一。 【关键词】 重组人生长激素； 生长激素受体； 血管内皮生长因子； 胃癌Abstract Objective：To inves

4、tigate the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on tumor growth and serum VEGF levels of human gastric carcinoma xenografts in nude mice.Methods：Sixty male nude mice were bought for the experiment.Immunocytochemistry method was used to detect the expression of growth hormone receptor(GH

5、R) in human gastric carcinoma cell lines SGC7901 and MKN45. Human gastric cell line SGC7901 with a positive expression of GHR and human gastric cell line MKN45 with a negative expression of GHR were injected subcutaneously into 4 nude mice respectively to create the subcutaneous xenografts models de

6、rived from human gastric carcinoma in nude mice.Three weeks later,the xenografts were picked out to make homogenate.Then injected subcutaneously into the remaining 52 nude mice.According to the different types of the injected cells, the nude mice were divided into GHR positive group and GHR negative

7、 group,then divided into three experimental groups:control group(C group:0.9%NaCl was given 0.2 mld-1), lowdose rhGH group(L group:rhGH was given 0.5 Ukg-1d-1) ,and highdose rhGH group(H group:rhGH was given 2.5 Ukg-1d-1),once a day for 14 days.The changes of body weight and tumor volume of nude mic

8、e in each group were recorded.The serum concentrations of VEGF in peripheral blood were analyzed by ELISA.Results:We defined SGC7901 as GHR positive group and MKN45 as GHR negative one.For GHR positive groups,the tumor volumes were significantly larger in rhGH administration groups than in the C gro

9、up(P0.05),and the H group revealed greater effect(P0.05).The serum VEGF concentrations of the L group and H group were (167.609.54) pgml-1 and (252.9415.32) pgml-1 respectively, much higher than which of the C group, with only (49.945.73) pgml-1（P0.05）；While for GHR negative groups, the body weights

10、 of the nude mice increased with the concentration of rhGH(P0.05).Conclusion：RhGH can promote the growth of tumor,and increase the expression of serum VEGF in the SGC7901 xenograft tumor model in which GHR is highly expressed.But not for the MKN45 xenograft tumor model in which the expression of GHR

11、 is almost undetectable.Key words recombinant human growth hormone; growth hormone receptor; vascular endothelial growth factor; gastric carcinoma胃癌患者发生营养不良较为常见,治疗应以延长患者生存期、改善生活质量为目标,不能仅仅针对肿瘤组织本身,应重视代谢支持与调理的作用,从整体增强机体免疫机能,从而提高抗肿瘤治疗疗效。重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)在改善患者营养状况、调节免疫功能方面存在

12、优势。由于生长激素(growth hormone,GH)具有促细胞有丝分裂效应,理论上具有潜在的促肿瘤生长作用,故其能否用于恶性肿瘤患者的代谢调理仍有争议。有报道1认为,rhGH不仅可促进肿瘤细胞增殖,而且可能与肿瘤血管新生有关,但尚无明确的理论证据。生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)的存在,则是GH发挥其生物学效应的关键2-3。本研究通过建立GHR差异表达的裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,给予不同剂量的rhGH干预,了解动物体内rhGH对肿瘤生长及血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。

13、1 材料和方法 1.1 细胞株和实验动物 人低分化胃癌细胞株SGC7901和MKN45购自中国科学院上海细胞生物研究所。BALBc,nunu,雄性裸鼠60只,购自上海斯莱克实验动物有限公司,鼠龄45周,体重1416 g,无特定病原体(SPF)条件下饲养。 1.2 主要药物和试剂 注射用重组人生长激素rhGH(珍怡)为上海联合赛尔生物工程有限公司产品。兔抗人GHR多克隆抗体,小鼠VEGF ELISA试剂盒,SABC免疫细胞化学试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。 1.3 实验方法1.3.1 胃癌细胞的GHR表达检测胃癌细胞株SGC7901和MKN45均在含10胎牛血清的RPM1640、37

14、、体积分数为5的CO2饱和湿度培养箱中培养。应用免疫细胞化学染色测定SGC7901和MKN45的GHR表达情况。操作步骤按说明书进行。细胞膜或细胞质棕黄色或棕褐色并呈颗粒状为阳性。高倍镜下(200)随机选择5个视野并分别计数100个细胞,根据阳性细胞占计数细胞的百分比,将免疫染色分级如下：阴性(-),染色细胞5；弱阳性(+),染色细胞为625；中等阳性(+),染色细胞为2650；强阳性(+),染色细胞51%。1.3.2 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立取处于对数生长期的胃癌细胞SGC7901和MKN45细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,台盼蓝拒染法计数活细胞数占95%以上。收集细胞

15、,调节浓度为2107个ml-1,随机选取4只裸鼠,右前肢腋下接种SGC7901细胞,0.2 ml只-1,同法,再取4只,接种MKN45细胞。7 d后接种部位可触及肿瘤组织,3周后可见直径1.52 cm肿块。引颈处死裸鼠,皮肤消毒,无菌条件下于右前肢腋下取出瘤块,置于有少许生理盐水的培养皿中,去掉坏死组织,称重,按瘤块重量,每 1 g 肿瘤加入4 ml生理盐水,于组织匀浆器中研磨,配成混悬液,浓度约为12107个ml-1,给26只实验裸鼠右前肢腋下接种SGC7901细胞的组织匀浆,0.2 ml只-1,同法将MKN45细胞的组织匀浆接种于另26只裸鼠右前肢腋下。10 d后可见52只裸鼠右前肢腋下均

16、形成直径约0.5 cm的肿瘤。1.3.3 实验分组与观察指标按接种胃癌细胞的类别不同,分别取24只接种SGC7901细胞的裸鼠和24只接种MKN45细胞的裸鼠，随机平均分为3组：L组注入rhGH 0.5 Ukg-1d-1；H组注入rhGH 2.5 Ukg-1d-1；C组（对照组）注入0.9%NaCl,0.2 mld-1。均予腹壁皮下注射,自肿瘤接种后第15至第28天,共14 d,每日观察裸鼠的行动、对外界刺激的反应、皮毛色泽及摄食情况。自第12至第30天,每3 d监测裸鼠的体重和皮下移植瘤的生长情况并记录,测量肿瘤长径(A)和垂直横径(B),按公式VAB2/2计算肿瘤体积,描绘肿瘤体积增长曲线。停药2 d后,每只裸鼠摘除眼球取血约0.3 ml,后处死裸鼠,取皮下移植瘤,并仔细检查其他脏器有无转移。1.3.4 血清VEGF含量检测将裸鼠眼球所取血液于室温下静置2 h,待血液凝固后,以3 000 rmin-1离心10 min,提取上层血清，于-80 冻存备检，以ELISA试剂盒检测各组血清中V