Nov12细胞衰老分子机理研究进展

1、1 生命科学永恒的主题生命科学永恒的主题 v “衰老”老年病老年病 百病之源百病之源。v老年病老年病 发病率发病率 老年性痴呆（ad） 65岁老人1/20 85岁以上老人 v人一生中医疗费人一生中医疗费 2/3用于晚年用于晚年 ？ 健康、长寿健康、长寿2000年年（第五次）我国人口普查我国人口普查 65岁岁 老人老人=总人口总人口10% 约约1.2亿亿65岁以上人口： 714 法国需114年 中国需 27年 （美国人口局，（美国人口局，u.s. census bureau预测）预测）2因老而衰： 预防老年病 造福个人与家庭 节约社会财富 解放生产力弄清衰老机理弄清衰老机理，可有的放矢有的放矢,

2、提出因应举措提出因应举措， 提高延衰效能。老年病种类繁多老年病种类繁多（老年性痴呆（老年性痴呆,帕金森病等神经退行性疾病帕金森病等神经退行性疾病,老年老年 糖尿病、骨质疏松、心、脑血管、呼吸等系统疾患糖尿病、骨质疏松、心、脑血管、呼吸等系统疾患,以及肿瘤以及肿瘤） 表现有别表现有别 发病各异发病各异3。 4如今，全球生命科学研究最热的三个领域是：全球生命科学研究最热的三个领域是： 衰老、肥胖和癌症，衰老在其中独占鳌头。衰老在其中独占鳌头。 人类对衰老的探究几乎从封建社会建立以来，就有所记载，然而，人类对衰老的探究几乎从封建社会建立以来，就有所记载，然而，真正进入科学研究衰老的范畴，还是近真正进

3、入科学研究衰老的范畴，还是近2020年的事。年的事。 现在，国内外科学家对衰老的研究主要集中在哪些方面？从哪些现在，国内外科学家对衰老的研究主要集中在哪些方面？从哪些角度进行研究？科学家都取得了怎样的成就？角度进行研究？科学家都取得了怎样的成就？ 生命世界衰老的科学研究策划案 03 30, 2006 生命世界中国科学院主管，中国科学院植物研究所、中国植物学会和高等教育出版社联合主办 5 各组织器官功能随年龄增加呈线型进行性下降各组织器官功能随年龄增加呈线型进行性下降406080100406080100功能百分比（）功能百分比（）年龄（年岁）年龄（年岁）神经传导速度神经传导速度心脏输出指数心脏输

4、出指数肾小球滤过速度肾小球滤过速度最大呼吸容量最大呼吸容量0.4%0.8%1.0%1.1% 人为什么会衰老？人为什么会衰老？ 6统计资料表明：子女的寿命常与双亲的寿命有关； 各种动物的最高寿限相当恒定。 衰老进程由环境衰老进程由环境（外因）（外因）与遗传与遗传（内因）（内因） 两大因素决定两大因素决定71992年世界卫生组织年世界卫生组织 人的寿命决定因素人的寿命决定因素 遗传因素遗传因素 15%社会经济因素社会经济因素 10%医疗服务技术医疗服务技术 8%气候因素气候因素 7%生活习惯、卫生行为、精神面貌、保健意识等生活习惯、卫生行为、精神面貌、保健意识等 60%？the results o

5、f human twin studies suggest that only 20-30% of the variation in survival to an age of about 85 years is determined by genetics a. m. herskind et al., hum genet 97, 319 , 19968平均寿命主要与环境相关平均寿命主要与环境相关；物种最高寿限与遗传相关物种最高寿限与遗传相关。不良环境可作用于遗传物质或其产物不良环境可作用于遗传物质或其产物 影响衰老进程影响衰老进程。 段建明等段建明等 （duan jm, et al.） int

6、l j biochem cell biol 37 (2005) 14071420 （基因对寿命的影响寿命的影响）线虫线虫(c. elegans )研究首次严格证明：单基因突变即可影响寿命。严格证明：单基因突变即可影响寿命。clk 基因与daf-2基因基因双突变，突变，线虫寿命延长寿命延长5 5倍倍。 基因对衰老进程的主导性基因对衰老进程的主导性9人类人类“长寿基因的探索长寿基因的探索 puca, aa （ childrens hosp ）与与perls, thomas（ boston univ ）等等（proc. natl. acad. sci. usa, 2001）报道：报道： 分析分析13

7、7组组 (308人人)长寿同胞，百岁老人血样长寿同胞，百岁老人血样发现：四号染色体发现：四号染色体 d4s1564 (d代表代表dna, d后的数字表示染色体号后的数字表示染色体号,s代代表节段表节段segment,s后的数字表示微卫星在染色体上的编号后的数字表示微卫星在染色体上的编号) 位点与众不同，位点与众不同，可能含有可能含有“长寿基因长寿基因”。 perls： 一年以后见分晓一年以后见分晓 ？10sebastiani p, et al.genetic signatures of exceptional longevity in humans. 老寿星老寿星的的遗传特征遗传特征 scie

8、nce 2010 jul 21. epub1055（ centenarians）：1267 （controls）分析结果：建立了以150 snps (single-nucleotide polymorphisms)为基础的 分类模型。 该模型用于另一组（百岁老人及其对照）：正确率 77% 。芯片分析显示：按差异snp（或遗传特征 ）不同组合，可将90%的百岁老人分成19个群体。一种组合可能与某一老年病(e.g., dementia, hypertension, and cardiovascular disease)易感性有关，或可由此将健康老人的表型分成不同亚型。 新英格兰百岁老人研究中心新英

9、格兰百岁老人研究中心(new england centenarian study) 11细胞模型相互配合，可补细胞模型相互配合，可补衰老的实验性研究成果累累12v细胞细胞 生物生物的的基本构成单位基本构成单位v细胞衰老细胞衰老 老年病发病老年病发病的的共同基础共同基础（人胚细胞可传人胚细胞可传60-70代，代，50岁成人细胞只能传岁成人细胞只能传1020代代）v理想状态：理想状态：人类细胞衰老模型与动物实验相辅相成人类细胞衰老模型与动物实验相辅相成动物整体实验相配合，可取长补短，相辅相成。动物整体实验相配合，可取长补短，相辅相成。13 细胞衰老 （cell senescence） 生物衰老的基

10、本单位生物衰老的基本单位 老年病发病的共同基础老年病发病的共同基础细胞衰老细胞衰老老年退行性变老年退行性变功能衰退功能衰退 增殖能力下降增殖能力下降细胞数减少细胞数减少脏器萎缩脏器萎缩 细胞衰老细胞衰老是造成个体衰老的主要原因之一。是造成个体衰老的主要原因之一。 14 体外培养人类细胞衰老模型体外培养人类细胞衰老模型在在研究人类衰老研究人类衰老方面，具方面，具有有不可取代不可取代的优点：的优点：无模式动物存在种族差异的缺点无人体实验取材难，操作难，周期长等缺点m. kuro-o(texas大学) “cell senescence has been suggested to be directl

11、y related to senescence of living organism, including humans.” cellular & molecular life sciences 57(2000):695-69715衰老机制复杂，单一的衰老相关指标难以准衰老机制复杂，单一的衰老相关指标难以准 确、特异地评估衰老程度。确、特异地评估衰老程度。 组建一套定量的细胞衰老生物学年龄指征组建一套定量的细胞衰老生物学年龄指征 准确定量细胞衰老程度，可准确定量细胞衰老程度，可1、研究各种因素对衰老进程的影响、研究各种因素对衰老进程的影响2、检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术、检验药物抗衰

12、作用，为中药现代化提供技术 支撑。支撑。16分子水平分子水平 细胞衰老指征细胞衰老指征 端粒长度端粒长度 细胞体外增殖能力细胞体外增殖能力 晚期糖基化终末产物晚期糖基化终末产物 衰老相关衰老相关-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 dna损伤修复能力损伤修复能力 dna甲基化程度甲基化程度 线粒体线粒体dna片段缺失片段缺失17我国端粒与人类细胞衰老相关性的研究我国端粒与人类细胞衰老相关性的研究端粒长度：端粒长度： 人类体细胞的计人类体细胞的计时器。每增加时器。每增加1 1代龄，端粒代龄，端粒长度减少约长度减少约49 bp49 bp。中国人外周血淋巴细胞的端粒长中国人外周血淋巴细胞的端粒长度每年平均

13、缩短度每年平均缩短35 bp35 bp。(张宗玉等，生物化学杂志,1995)southern blotstelomere lengths+细胞越老，端粒越短，细胞越老，端粒越短，电泳时电泳时跑得越快跑得越快18人胚成纤维细胞体外培养代龄与细胞增殖速度的关系人胚成纤维细胞体外培养代龄与细胞增殖速度的关系 细胞的体外增殖能力细胞的体外增殖能力 广泛应用于衰老研究。growth curves mtt assay19人胚肺二倍体成纤维细胞人胚肺二倍体成纤维细胞(绿色者为衰老细胞绿色者为衰老细胞)衰老相关衰老相关半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性衰老细胞衰老细胞年轻细胞年轻细胞sa-gal staining

14、20 dna损伤修复能力损伤修复能力 随增龄而下降随增龄而下降comet assay彗星试验彗星试验（单细胞凝胶电泳） 尾长尾长(m) ；尾面积；尾面积/总面积总面积(%) 尾越长，尾越长，%越高，损伤越重越高，损伤越重21 晚期糖基化终末产物晚期糖基化终末产物 蛋白质糖基化与大分子交联，逐渐脱水，形成的一种具有黄棕色荧光的产物。determination of age (advanced glycation end product)22从分子水平组建一套从分子水平组建一套 为国际所承认的为国际所承认的 细胞衰老生物学指征。细胞衰老生物学指征。我室在国外刊物的部分相关论文我室在国外刊物的部分相

15、关论文：duan jm, int j biochem cell biol, 2005, 37:1407-1420zheng wj, et al. j biol chem 2004,279:31524-31532guo sz, et al. exp cell res 2004,298:465-472 huang y, et al. j cell physiol, 2004, 201: 483-491. zhang xw, et al. oncogene 2003, 22 : 2405-2416 wang pc, et al. mech age dev 2003,124: 1025-1034 du

16、an jm, et al. j biol chem 2001 276: 48325-48331.li jh, et al. mech age dev 1995,80:25-34. tang zq , et al. mech age dev 1994,73:57-67. 基因水平基因水平 细胞衰老指征？细胞衰老指征？231.5%1.0%0.5%-0.5%-1.0%-1.5% 2.0倍 2.5倍 3.0倍用cdna芯片检测人二倍体成纤维细胞衰老基因表达谱的变化hgec-40s: 含4096条人类基因，衰老表达差异较大的基因有117种。24细胞衰老的基因表达谱研究 衰老细胞与年轻细胞基因（衰老细胞与

17、年轻细胞基因（4096条）芯片条）芯片杂交信号强度散点图杂交信号强度散点图-2-巨球蛋白巨球蛋白 在4096条人类基因的cdna微阵列表达谱中发现年轻和衰老细胞中表达变表达变化在化在5 5倍以上的基因倍以上的基因有有6 6种。种。其中-2-2-巨球蛋巨球蛋白基因白基因不仅在衰老的成纤维细胞表达明显增高，在年轻细胞中的表达水平亦较其它5种基因高，易检出，易定量。 青老25衰老过程中基因表达谱的变化衰老过程中基因表达谱的变化4096种中表达变化幅度种中表达变化幅度2.5倍的基因倍的基因46种种。下调的基因：参与细胞周期的基因等。下调的基因：参与细胞周期的基因等。上调的基因：细胞外基质有关基因等。上

18、调的基因：细胞外基质有关基因等。挑选表达变化大的基因，以挑选表达变化大的基因，以rt-pcr技术对其再技术对其再检测。检测。26 衰老时表达下降的衰老时表达下降的4种基因种基因27 衰老时表达增强的衰老时表达增强的5种基因种基因优选优选28衰老过程中衰老过程中-2-巨球蛋白、巨球蛋白、p16ink 4a和和p21waf1基因表达与代龄关系基因表达与代龄关系-2-巨球蛋白p16ink4ap21waf1将将-2-巨球蛋白，巨球蛋白，与众所公认的细胞衰老与众所公认的细胞衰老时表达增强的基因时表达增强的基因p16ink4a及及p21waf1相比相比较，从中选出最适合作较，从中选出最适合作为衰老标志物的

19、基因为衰老标志物的基因29northern blot 检测检测2bs细胞衰老过程中细胞衰老过程中 -2-巨球蛋白巨球蛋白（alpha-2- macroglobulin, 2m）的基因表达情况的基因表达情况gapdh2m代龄代龄 28 42 52 62细胞衰老标志基因的选定细胞衰老标志基因的选定30结论：-2-巨球蛋白基因表达巨球蛋白基因表达，与体外培养倍增次数线性关系良线性关系良好好，易检出，易定量易检出，易定量是一项很好的衰老生物学标志，并有望用于检测整体水平或组织细胞的衰老。 马马 宏等宏等（ma h , et al）exp gerontol 2004 31衰老细胞核出现“衰老相关衰老相关

20、异染色质聚集位点异染色质聚集位点”（senescence- associated heterochromatic foci，sahf） 染色质在核中的分布，呈点状聚集而非均一分布染色质在核中的分布，呈点状聚集而非均一分布 李 倩 等：sahf细胞衰老生物学新标志细胞衰老生物学新标志 。 生物化学与生物物理进展 2007,34:1123-1128. 32 1寻找影响细胞衰老的新基因寻找影响细胞衰老的新基因 发现：延缓衰老的csig与rdl 证明：导入csig或rdl基因可延长细胞寿命。 2研究各种因素研究各种因素（如氧自由基）（如氧自由基）对衰老进程的影响对衰老进程的影响 3用于研究已知基因对细

21、胞衰老的影响用于研究已知基因对细胞衰老的影响 发现：已知基因tom1可加速衰老，抑制可延长细胞寿命 证明：基因导入可影响细胞衰老，可加速，也可延缓。 4检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术支撑检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术支撑 细胞衰老指征细胞衰老指征的的应用应用 33 为验证我室建立的衰老指标评价体系，评估抗衰为验证我室建立的衰老指标评价体系，评估抗衰新药，我们研究了黄芪新药，我们研究了黄芪碱碱hdtic的抗衰作用。的抗衰作用。 检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术支撑检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术支撑能否确定被试物的 延衰作用？能否比较被试物延衰作用的细微差别？34黄芪

22、碱黄芪碱 同分异构体 以公认有延缓衰老作用的以公认有延缓衰老作用的肌肽肌肽（carnosine）为）为阳性对照，以上述生物学指征进行定量比较。阳性对照，以上述生物学指征进行定量比较。 成果应用成果应用结构差异（黄芪碱黄芪碱1）（黄芪碱黄芪碱2）（a）hdtic-1， (b)hdtic-235黄芪碱黄芪碱的抗衰效应强于肌肽（的抗衰效应强于肌肽（carnosinecarnosine） 黄芪碱（黄芪碱（hdtic）可）可延长细胞寿命延长细胞寿命20代（代（ cpds）成果应用成果应用（黄芪碱黄芪碱1）（黄芪碱黄芪碱2）36 黄芪碱黄芪碱可减慢端可减慢端粒粒（kb数）缩短速度缩短速度2828代代555

23、5代代对照对照8.93 0.547.01 0.430.1m黄芪碱黄芪碱1 18.93 0.548.08 0.49成果应用成果应用37阳性阳性(绿色绿色)率率随代龄的增加而增加随代龄的增加而增加黄芪碱黄芪碱可降低衰老相关可降低衰老相关半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性（ 28代代）（ 55代）代）1.0m黄芪碱黄芪碱-2 （ 56代）代）成果应用成果应用0.1m黄芪碱黄芪碱-1 （ 58代）代）38 dna损伤修复能力损伤修复能力 随增龄下降随增龄下降修复良好修复不良黄芪碱黄芪碱可提高可提高dna损伤修复能力损伤修复能力 成果应用成果应用衰衰 尾长尾长(m) 面积面积/总面积总面积(%) 对照对照 1

24、22.426.21 92.123.25 0.1m黄芪碱黄芪碱-1 80.575.44 70.827.51 1.0m黄芪碱黄芪碱-2 81.839.37 73.146.34 尾越长，尾越长，%越高，越高，损伤越重损伤越重39黄芪碱黄芪碱的抗衰效应强于肌肽（的抗衰效应强于肌肽（carnosinecarnosine）黄芪碱黄芪碱1的抗衰效应强于的抗衰效应强于黄芪碱黄芪碱2黄芪碱黄芪碱（hdtic）可）可减少晚期糖基化终末产物（减少晚期糖基化终末产物（ ages）（代龄代龄）（黄芪碱黄芪碱1）（黄芪碱黄芪碱2） 王培昌王培昌等 （ wang pc , et al）mech age dev 2003 c

25、hin med j 2008 dna cell biol 2010 成果应用成果应用40人类人类细胞衰老相关基因细胞衰老相关基因的的研究研究 41细胞衰老基因通路细胞衰老基因通路 rb p21cip1 p27kip1 p16ink4a p53 pten细细 胞胞 衰衰 老老42 人类细胞衰老相关基因研究人类细胞衰老相关基因研究p16ink4a43kiyone 等等(1998）认为：认为： p16活性活性与与端粒长度是决定人类细胞复制性衰老的关键。端粒长度是决定人类细胞复制性衰老的关键。 p16为何能影响细胞衰老？为何能影响细胞衰老？ 我研究室工作：p16是如何影响端粒长度与衰老进程的？是如何影

26、响端粒长度与衰老进程的？ 是否影响了端粒酶的活性？是否影响了端粒酶的活性？抑制p16表达，可使可使 细胞寿命细胞寿命 （60余代余代 80余代）余代） 端粒缩短减慢端粒缩短减慢 结论： 基因干预可影响细胞衰老进程基因干预可影响细胞衰老进程44端端粒粒平平均均长长度度 (kb)年年轻轻 8.34抑抑制制 8.18增增强强 7.12衰衰老老 6.78抑制抑制 p16，端粒缩短端粒缩短减慢减慢增强增强 p16，端粒缩短端粒缩短加快加快是否影响了端粒酶的活性？是否影响了端粒酶的活性？45抑制抑制 p p1616，并未活化，并未活化端粒酶端粒酶46抑制抑制 p16 ，dna修复能力增强修复能力增强抑制抑

27、制 p16 ，dna修复能力增强修复能力增强47 抑制抑制p16，延缓细胞衰老的可能机制，延缓细胞衰老的可能机制 减少减少 细胞周期细胞周期 蛋白激酶蛋白激酶( (cdk4）活性高）活性高 被磷酸化，失去活性被磷酸化，失去活性 转录因子转录因子e2f活性高活性高多种多种生命必需基因能表达生命必需基因能表达 维持维持细胞细胞增殖速度增殖速度, ,维持维持dnadna损伤修复能力损伤修复能力 端粒缩短较慢端粒缩短较慢, ,延缓细胞衰老延缓细胞衰老（需证明rb是否磷酸化！）48段建明等段建明等（ duan jm, et al.） ， j. biol. chem. 2001western blot抑制

28、抑制 p16 年轻年轻 对照对照 中年中年 衰老衰老49p16 影响细胞衰老机制影响细胞衰老机制 抑制抑制p16表达表达 cdk4活性活性 rbrb蛋白（磷酸化蛋白（磷酸化 ）活性活性 e2f活性保持活性保持多种多种生命必需基因表达生命必需基因表达 dna修复能力维持修复能力维持端粒缩短较慢端粒缩短较慢（与端粒酶活性无关与端粒酶活性无关） 延缓衰老延缓衰老，细胞寿命细胞寿命 增强增强p16基因表达基因表达 rb 保持活力，保持活力，dna修复能力修复能力 端粒缩短加快端粒缩短加快,衰老衰老 ，细胞寿命细胞寿命50结论：结论：p p16基因基因是细胞衰老遗传控制是细胞衰老遗传控制程序中的主要环节

29、程序中的主要环节, , 可影响可影响dnadna损伤修复能力与损伤修复能力与端粒长度端粒长度 。它调节。它调节rbrb蛋白的活性而起作蛋白的活性而起作用。用。 （-2-巨球蛋白基因无此作用巨球蛋白基因无此作用）51薛丽香等薛丽香等 （ xue lx, et al.） febs lett 2004, 564 :199-204 p16高表达高表达 (细胞衰老细胞衰老)细胞衰老相关基因细胞衰老相关基因p2152入选“2002年中国十大科技进展”53cawthon r.m等（2003）端粒长短与人的寿命有关端粒长短与人的寿命有关，发现血细胞端粒短的人寿命短。心脏病心脏病病死率是端粒长的人3.18倍，传

30、染病传染病病死率是端粒长的人8.54倍。nakashima h等（2004）发现：人血白细胞端粒长度端粒长度与心血管内皮损伤，动脉粥样硬化动脉粥样硬化的关系密切。demerath ew等（2004）报道：端粒短与老年糖尿病糖尿病，创伤愈创伤愈合合慢，免疫免疫功能下降，易生肿瘤肿瘤有关。端粒长度与老年病易感性有关？端粒长度与老年病易感性有关？细胞衰老细胞衰老不能替代整体衰老，但与整体衰老有关，与老与整体衰老有关，与老年常见多发病有关。年常见多发病有关。细胞衰老细胞衰老与与整体衰老整体衰老有关有关54老年人群的老年人群的p16基因多态性与体能（基因多态性与体能（physical function）

31、显著相关。显著相关。 melzer, d; frayling, tm; murray, a, et al. （英、意、美）a common variant of the p16(ink4a) genetic region is associated with physical function in older people mech ageing dev 128（5-6）: 370-377，2007 938 (aged 65-80 years)例英国老人，rs2811712 snp minor allele (located between the shared p16(ink4a)/arf

32、 locus and p15(ink4b) was associated with reduced physical impairment. first direct evidence ： p16 (ink4a)/arf/p15(ink4b) genetic region and senescence machinery are active in physical ageing in heterogeneous human populations. 55p16在细胞衰老时表达在细胞衰老时表达 ，如成纤维细胞、角质细胞、上皮细胞、t淋巴细胞、内皮细胞、黑色素细胞,甚至可高于年轻时10倍以上。

33、p16表达变化与整体衰老表达变化与整体衰老相关。人体衰老时它的表达在皮肤中人体衰老时它的表达在皮肤中随增龄持续增强，随增龄持续增强，维氏综合征病人的皮肤维氏综合征病人的皮肤成纤维细胞p16ink4a高于常人（davis t, 2004 ）ressler s, et al. p16(ink4a) is a robust in vivo biomarker of cellular aging in human skin. aging cell 5 (5): 379-389，200656 p16ink4a表达表达 是老年人造血功能是老年人造血功能 的重要原因的重要原因干细胞衰老影响组织的维持与修复。

34、干细胞衰老影响组织的维持与修复。老年人的骨髓对细胞毒耐受性差，易衰竭老年人的骨髓对细胞毒耐受性差，易衰竭。研究表明：研究表明：老年鼠造血干细胞更新能力老年鼠造血干细胞更新能力 ，分化时间长，易凋亡。，分化时间长，易凋亡。敲除p16/p19，衰老的上述不利影响减轻，有利于组织在衰老时的损伤修复。janzen v, et al.（ harvard univ ）stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16ink4a nature. 443 (7110): 421-426，200657 干细胞衰老与干细胞衰

35、老与p16表达增强密切相关表达增强密切相关年轻小鼠敲除p16后对其造血干细胞功能（免疫表型，归巢能力，增殖能力，自我更新能力）无影响，老年小鼠敲除老年小鼠敲除p16造造血干细胞功能血干细胞功能 显著显著（优于同龄鼠）（优于同龄鼠）。janzen, v; forkert, r; fleming, he, et al. stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16(ink4a) nature 443（7110）: 421-426，200658胰岛再生能力与胰岛再生能力与p16ink4a表达水平有关表达水

36、平有关小鼠实验小鼠实验：衰老 胰岛p16表达 （其他细胞周期抑制物无此现象 ）p16转基因鼠 衰老快，胰岛细胞增殖能力 毒物 胰岛 愈老、生存率愈低愈老、生存率愈低 毒素作用后，胰岛不可再生毒素作用后，胰岛不可再生 p16表达; 生存率与年龄无关生存率与年龄无关 毒素作用后，胰岛可再生毒素作用后，胰岛可再生结论结论p16表达表达 老年鼠老年鼠 胰岛增殖和再生能力胰岛增殖和再生能力重要原因重要原因 p16(ink4a) induces an age-dependent decline in islet regenerative potential nature 443 : 453-457, 20

37、06 univ north carolina,harvard medical school 59骨关节炎(老年病)软骨细胞p16表达p16特异sirna转染导致的p16基因沉默可有效抑制关节软骨细胞衰老，恢复其功能，增强软骨细胞dna合成与胶原蛋白合成能力。 （ zhou hw, et al. rheumatology.2004, 43: 555-）p16不仅与细胞衰老有关，与整体衰老亦有关。不仅与细胞衰老有关，与整体衰老亦有关。60 p16表达调控研究表达调控研究61绿色荧光蛋白量与其荧光强度成正比绿色荧光蛋白量绿色荧光蛋白量与其荧光强度成与其荧光强度成正比正比-280-622区段青，老差别

38、的变化最大区段青，老差别的变化最大不同长度 p16调控区 的 启动活性分析 62d d n n a a 上上 转转 录录 因因 子子 结结 合合 位位 置置 的的 确确 定定(f o o t p r in t in g )np(g)0 80 120 80 120 c y 0 g+adnase i footprinting of the region from 622 to 288 of the p16 promoter. the fragment was 3 end labeled (coding strand) and incubated with nuclear extracts of y

39、oung and senescent cells. aliquots of the probes were chemically treated as for maxam-gilbert sequencing of g+a residues to give markers. a, b and c indicated three dnase i protection regionsabcp16p16基因翻译起基因翻译起始信号始信号atgatg以远以远上游上游 -491 -491 -485 bp -485 bp 处存在处存在我们称为我们称为itse (ink4a transcription sil

40、ence element,p16,p16转转录沉寂元件录沉寂元件) )的的负调控元件。负调控元件。63结果：人结果：人2bs2bs细胞细胞p16p16基因上游存在一个由基因上游存在一个由gaaggtgaaggt构成的负调控元构成的负调控元件件itse，且发现，且发现年轻细胞有年轻细胞有24kda蛋白与负调控元件蛋白与负调控元件结合结合，抑制，抑制p16p16表达表达，衰老细胞缺乏此蛋白质。衰老细胞缺乏此蛋白质。 用缺失突变删除该元件，能否使用缺失突变删除该元件，能否使p16表达增强？表达增强？- -6 63 30 0c ct tt ta ag gt tc cg gt ta a c ca ag

41、gg gt tg ga at tt tt t c cg ga at tt tt tc ct tc cg g g gt tg gg gg gg gc ct tc ct t c ca ac ca aa ac ct ta ag gg g- -5 58 80 0 a aa aa ag ga aa at ta ag gt t t tt tt tg gc ct tt tt tt tt t c ct tt ta at tg ga at tt ta a a aa aa ag ga aa ag ga aa ag g c cc ca at ta ac ct tt tt tc c - -5 53 30 0 c cc

42、 ct ta at tg ga ac ca ac c c ca aa aa ac ca ac cc cc cc c g ga at tt tc ca aa at tt tt t g gg gc ca ag gt tt ta ag gg g a aa ag gg gt tt tg gt ta at t- -4 48 80 0 c cg gc cg gg ga ag gg ga aa a g gg ga aa aa ac cg gg gg gg g c cg gg gg gg gg gc cg gg ga a t tt tt tc ct tt tt tt tt ta a a ac ca ag ga

43、 ag gt tg ga aa a - -4 43 30 0 c cg gc ca ac ct tc ca aa aa a c ca ac cg gc cc ct tt tt tg g c ct tg gg gc ca ag gg gc cg g g gg gg gg ga ag gc cg gc cg g g gc ct tg gg gg ga ag gc ca a - -3 38 80 0 g gg gg ga ag gg gc cc cg gg g a ag gg gg gc cg gg gt tg gt t g gg gg gg gg gg gc ca ag gg g t tg gg

44、gg gg ga ag gg ga ag g c cc cc ca ag gt tc cc ct tc c- -3 33 30 0 c ct tt tc cc ct tt tg gc cc c a aa ac cg gc ct tg gg gc ct t c ct tg gg gc cg ga ag gg gg g c ct tg gc ct tt tc cc cg gg g c ct tg gg gt tg gc cc cc cc c- -2 28 80 0 c cg gg gg gg gg ga ag ga ac c c cc ca aa ac cc ct tg gg gg g g gc

45、cg ga ac ct tt tc ca ag g g gg gg gt tg gc cc ca ac ca a t tt tc cg gc ct ta aa ag gt t - -2 23 30 0 g gc ct tc cg gg ga ag gt tt t a aa at ta ag gc ca ac cc ct t c cc ct tc cc cg ga ag gc ca a c ct tc cg gc ct tc ca ac ca a g gc cg gt tc cc cc cc ct tt t - -1 18 80 0 g gc cc ct tg gg ga aa aa ag g

46、a at ta ac cc cg gc cg gg gt t c cc cc ct tc cc ca ag ga ag g g ga at tt tt tg ga ag gg gg g a ac ca ag gg gg gt tc cg gg g - -1 13 30 0 a ag gg gg gg gg gc ct tc ct t t tc cc cg gc cc ca ag gc ca a c cc cg gg ga ag gg ga aa ag g a aa aa ag ga ag gg ga ag gg g g gg gc ct tg gg gc ct tg gg g -8 80 0

47、t tc ca ac cc ca ag ga ag gg g g gt tg gg gg gg gc cg gg ga a c cc cg ga ag gt tg gc cg gc c t tc cg gg gc cg gg gc ct tg g c cg gg ga ag ga ag gg gg gg g- -3 30 0 t ta ag ga ag gc ca ag gg gc c a ag gc cg gg gg gc cg gg gc c g gg gg gg ga ag gc ca ag gc c a at tg g rsaismai5-oligo3-oligothe partial

48、 sequence of p16ink4apromoter y o14.4kda20.1kda30.0kda43.0kda67.0kda94.0kdasouthwestern blotting of the region from 622 to 288 of the p16 promoter. end-labeled probe was hybridized with nuclear extracts of young and senescent 2bs cells, which were separated by sds-page electrophoresis and transfered

49、to nitrocellulose membrane. a 24kda binding protein was observed only in young cells and 15.5kda binding protein could be detected in both cells.64100100172.05172.0559.7559.750 05050100100150150200200relative seap activityrelative seap activitypseap-3mutpseap-5mutpseap-870定点缺失突变证明：定点缺失突变证明：itseitse是

50、负调控元件是负调控元件以分泌型碱性磷酸以分泌型碱性磷酸酶（酶（seap） 活性活性体现启动活性体现启动活性删除前删除前删除后删除后年轻细胞的年轻细胞的p16基因调控区在删除基因调控区在删除-522 -482后后启动活性反而增高启动活性反而增高 65发现序列为gaaggt的负调控元件，位于p16基因翻译起始信号atg以远上游-491-485bp处。发现p16的负转录因子（分子量约2.4万）。汪维等汪维等（ wang w, et al.） ： j biol chem.2001, 276(52), 48655-48661 66负负 汪维等汪维等（ wang w, et al.） ： j biol c

51、hem.2001, 276：48655 郑文婕等郑文婕等（zheng wj , et al.）： j biol chem.2004,279 : 31524（间接间接负负调调 id1） 吴军峰等吴军峰等（wu jf , et al.） ： plos one 2007, 2: e164 （直接直接正调正调 sp1） 黄菁等黄菁等（huang j, et al.）： plos one 2008, 3: e1710. （间接间接负负调调 sirt1） 甘起霓等甘起霓等（gan qn, et al.） ： j cell sci 2008,121:2235 （直接直接正调正调 ppar ） 周瑞等周瑞等（

52、zhou r , et al.） ： nucleic acids res 2009, 37:5183 （间接间接负负调调 lsh） 李红凯等李红凯等（li, hk, et al.）： oncogene 2010, jun 28网刊（直接直接正调正调 hbp1） 黄昱等黄昱等（huang y,et al. ） ：cell mol life sci 2010, aug 25网刊（直接直接负负调调 b-myb）67 影响影响mrna稳定性稳定性的的rna结合蛋白结合蛋白 hur （直接负调直接负调 ） auf1 （直接负调直接负调 ） auf1与与hur与与p16的的mrna 非翻译区结合结合,促降

53、解。促降解。 衰老时衰老时， p16的mrna稳定性 。 王文恭等王文恭等（ wang wg, et al.） embo reports 2005 ,6:1 常娜等常娜等（ chang n, et al.） mol cell biol 2010 , 30:3875mir-24可抑制可抑制p16翻译翻译（lal a, et al ）plos one 2008,3: e1864 （直接负调直接负调） 68细胞衰老相关新基因的研究细胞衰老相关新基因的研究 69tom1是一种溶酶体相关基因，在细胞衰老时高表达是一种溶酶体相关基因，在细胞衰老时高表达 。首次揭示：首次揭示：tom1tom1基因与细胞衰老

54、相关。基因与细胞衰老相关。促进促进tom1表达可加速衰老，表达可加速衰老，引起引起p16及及p21表达表达。如抑制之，结果相反。如抑制之，结果相反。 加速衰老的加速衰老的tom1 (target of myb)郭淑贞郭淑贞等等（ guo sz et al.） exp cell res 2004,298:465-47270rdl基因基因的蛋白质产物的蛋白质产物具有延缓衰老作用具有延缓衰老作用 发现其蛋白质分子中存在着发现其蛋白质分子中存在着“衰老相关结构域衰老相关结构域”这种作用可能是通过这种作用可能是通过抑制抑制细胞衰老主导基因细胞衰老主导基因 p16的表达而实现的表达而实现延缓衰老的延缓衰老

55、的rdl（replicative senescence down-regulated leo1-like）赵亮等赵亮等（ zhao l, et al.） faseb j 2005,19: 521-532 71csig蛋白定位于核仁；蛋白定位于核仁；在组织中广泛表达，在组织中广泛表达，心脏、骨骼肌、胎盘中表达较高；心脏、骨骼肌、胎盘中表达较高；随细胞增龄表达下降；随细胞增龄表达下降；具有延缓细胞衰老的作用。具有延缓细胞衰老的作用。 csig通过抑制通过抑制pten的合成，延缓衰老。的合成，延缓衰老。 马利伟等马利伟等 （ ma lw, et al.） mol cell biol 2008，28:

56、 6290-6301 延缓衰老的延缓衰老的csig (cellular senescence-inhibited gene) 72整体衰老与细胞衰老分子整体衰老与细胞衰老分子连接点的研究连接点的研究 73酵母中发现的“ 长寿基因长寿基因” sir （silencing information regulator） 该基因产物sir2（依赖依赖nad+去乙酰化酶去乙酰化酶 ）具有延寿作用具有延寿作用 维持染色体稳定性维持染色体稳定性提高提高dna修复能力修复能力阻止染色体外环形阻止染色体外环形dna形成形成7475人类人类sir同源基因同源基因该家族有7个成员，包括sirt（silent mat

57、ing type information regulation 2 homolog）1-7。其中sirt1具有酵母sir2的相似功能耗氧量耗氧量 调节脂代谢调节脂代谢氧化、放射损伤耐受性氧化、放射损伤耐受性 对人类是否也有延寿作用？对人类是否也有延寿作用？76sirt1可延缓细胞衰老进程可延缓细胞衰老进程sirt1或或resveratrol处理处理 p16、p27表达表达 rb磷酸化磷酸化 细胞衰老细胞衰老 sirt1表达表达 （翻译（翻译 ） ppar 细胞衰老细胞衰老 ppar 表达表达 细胞衰老细胞衰老 sirt1 ppar 表达表达 细胞衰老细胞衰老 人二倍体成纤维细胞研究人二倍体成纤

58、维细胞研究甘起霓等甘起霓等（gan qn , et al.） j cell sci 2008, 28: 6290-6301. 黄菁等黄菁等（huang j, et al. ） plos one 2008, 3(3): e1710.77cr（热量限制）（热量限制）sirt1huang j, et al. plos one 2008ppar senescence gan qn , et al. j cell sci 2008p16 ink4 热量限制热量限制延缓衰老延缓衰老的的分子机理分子机理young +- + 促表达- - 抑表达-han, lm, et al. nucleic acids r

59、es 2010 78结语结语衰老并非单一基因决定，而是一连串基因激活和阻抑及其通衰老并非单一基因决定，而是一连串基因激活和阻抑及其通过各自产物相互作用的结果，环境损伤因素可影响遗传控制过各自产物相互作用的结果，环境损伤因素可影响遗传控制体系，加速衰老。体系，加速衰老。对衰老进程起作用的基因，多数是日常生命活动有关基因对衰老进程起作用的基因，多数是日常生命活动有关基因。（解旋酶 、核纤层蛋白a 、p16、p21、p53、 klotho 、 daf 、clk ） 可对衰老进程起作用的基因未必在细胞正常衰老进程起作用。可对衰老进程起作用的基因未必在细胞正常衰老进程起作用。 （如端粒酶基因、p53 ）

60、衰老时高表达的基因未必是对衰老进程起作用的基因。衰老时高表达的基因未必是对衰老进程起作用的基因。（2m ） 在体外通过基因重组在体外通过基因重组“长寿基因长寿基因”与与“衰老基因衰老基因”是可以相是可以相互转变的。互转变的。79展望展望 如何将从模式生物发现的衰老相关基因如何将从模式生物发现的衰老相关基因 与人类衰老相联系？与人类衰老相联系？ 如何将早老症相关基因与正常衰老相联如何将早老症相关基因与正常衰老相联 系？系？ 如何将细胞衰老相关基因与整体衰老相如何将细胞衰老相关基因与整体衰老相 联系？联系？ 机理研究机理研究 衰老相关基因绝非一种，探索衰老相关新基因衰老相关基因绝非一种，探索衰老相