氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察

1、氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察 08-12-23 09:42:00 作者：朱毅编辑：studa20【摘要】 目的：探讨氟达拉滨气道滴入对小鼠仙台病毒性肺炎是否具有治疗作用。方法:将21只ICR小鼠随机分为对照组、仙台病毒组和仙台病毒加氟达拉滨治疗组。接种病毒和用药7 d后评价各组一般状况、病理学表现，测定肺组织信号转导和转录活化因子1（signal transduction and activation of transcription 1，STAT1）核酸和蛋白表达水平。结果:仙台病毒经鼻滴入可引起严重的肺部炎症，肺组织STAT1 mRNA和蛋白表达下降（P0.05）。氟达拉滨治疗

2、组虽STAT1核酸和蛋白表达下降，但肺部炎症反应较仙台病毒组轻，淋巴细胞浸润程度较仙台病毒组轻（P0.05）,动物一般情况有所改善。结论:氟达拉滨气道滴入在仙台病毒导致的小鼠病毒性肺炎中具有减轻气道炎症、抑制淋巴细胞募集和改善动物一般状况的作用。该作用与氟达拉滨抑制STAT1合成的作用无关，而可能与其抑制淋巴细胞的作用有关。 【关键词】 氟达拉滨 仙台病毒 信号转导和转录活化因子1 小鼠 肺部病毒性疾病种类众多，由于其发病机制还不完全明了，临床往往使用糖皮质激素对过度强烈的免疫反应进行抑制，情况如近年出现的传染性非典型性肺炎（SARS）。但长期大量使用激素的副作用明显，且激素在抑制炎症方面并非

3、总是最佳选择，因此需要其他高效、安全的药物作为激素治疗的替代和补充。 信号转导和转录活化因子1（signal transduction and activation of transcription 1, STAT1）被认为与机体的抗病毒免疫和炎症过程密切相关，它的活化虽为抗病毒免疫必需，但过度活化的STAT1却与炎症的放大有密切关系。因此STAT1通路就成为炎症性疾病治疗的靶点之一。磷酸氟达拉滨（fludarabine phosphate， FaraAMP），又名福达华（fludara），化学名9D阿拉伯酸呋喃糖2氟腺嘌呤5磷酸盐，分子式为C10H13FN5O7P,主要用于血液系统恶性疾病如

4、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的治疗，具有抑制T淋巴细胞的作用1。此外，新近国外研究表明氟达拉滨在体外还有抑制STAT1表达的作用，提示该药在免疫反应过度的疾病中具有潜在应用价值。本研究旨在初步探讨其在病毒性肺炎治疗中的抗炎效果及吸入治疗的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 7周龄ICR清洁级小鼠21只，雌雄不拘，质量(22.91.2)g，购自江苏省实验动物中心；仙台病毒由南京医科大学免疫教研室惠赠；磷酸氟达拉滨为意大利先灵葆雅公司产品；兔抗鼠STAT1多克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG均购自Santa Cruz；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录酶M

5、MLV和Taq DNA聚合酶为Promega产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；显微镜和图像分析软件为Zeiss AxioCam MR color；垂直电泳及蛋白半干转印设备和凝胶扫描仪均为BioRad；Band Leader凝胶条带分析软件。 1.2 方法 1.2.1 动物分组 21只小鼠随机分为3组，每组7只，为对照组（A组）、仙台病毒组（B组）和仙台病毒加氟达拉滨治疗组（C组）。 1.2.2 仙台病毒滴度测定和仙台病毒肺炎模型的建立 取新鲜鸡全血，分离红细胞。在血凝板中每孔加入0.5 ml 0.5%的鸡红细胞PBS悬液, 共8孔。每孔再加入0.5 ml仙台病毒鸡胚尿囊液，浓度从1/

6、10到1/1 280成倍递减，另设一孔为阴性对照。室温静置30 60 min后观察血凝结果，红细胞呈伞状在血凝板底部沉积，边缘略呈伞状翻卷为阳性，血球呈点状沉积于血凝板底部者为阴性。以阳性结果的最高稀释度为血凝效价。本实验采用的仙台病毒血凝效价为1320。小鼠吸入乙醚作轻度麻醉后，A组经鼻滴入50 l PBS，B、C组动物均经鼻滴入同体积仙台病毒鸡胚尿囊液制备仙台病毒肺部感染模型，C组同时滴入0.04 mgml-1的氟达拉滨PBS溶液25 l。 1.23 氟达拉滨用药方法 参照我们以往实验结果，选择0.001 mg只-1为气道局部用药剂量2。 1.2.4 动物一般状况和大体病理观察 每日记录小

7、鼠体质量，观察动物一般状况。7 d后将小鼠脱颈椎处死后取肺组织，将左肺上叶置10%中性福尔马林中固定行连续石蜡切片(厚4 m) ,常规苏木素伊红（HE）染色行病理观察；右肺中下叶同样方法固定以备免疫组织化学分析；左下叶肺组织冻存于-70 作Western Blotting分析。 1.2.5 支气管厚度测定 参照王丽新等的方法，采用图像分析法在HE染色的石蜡切片中选择气道壁完整的横断小气道,测量该气道的内周长和长径轴上相反两个方向的气道壁厚度。结果以两个厚度和与内周长之比的百分数表示为厚度(%)，该方法可排除支气管口径大小对测量结果的影响3。 1.2.6 Western Blotting 取冰冻

8、肺组织100 mg充分匀浆后加入Trizol 1 ml，静置5 min后加氯仿0.2 ml振摇。12 000 g离心后取有机相，加入乙醇使DNA沉淀，低速离心去除DNA沉淀后加2 ml异丙醇使蛋白质沉淀，12 000 g离心后用盐酸胍乙醇溶液洗涤蛋白质块3次，用1 ml 1%SDS使蛋白质溶解。Bradford法测定蛋白浓度，调至1 mgml-1，与上样缓冲液混合煮沸后每个泳道加样20 l。聚丙烯酰胺凝胶电泳后湿式转印至硝酸纤维薄膜，一抗、二抗孵育后DAB显色。将免疫印迹所得结果经图像扫描分析，选择其中1条泳道的蛋白质条带作标准进行灰度测定。根据平均灰度与STAT1含量呈正比的原理，计算每个泳

9、道STAT1的相对含量。 1.2.7 RTPCR测定STAT1 mRNA相对表达 肺组织经Trizol提取总RNA后，MMLV（Promega）逆转录合成第一链。取第一链cDNA产物2 l进行后续PCR反应。STAT1上游引物序列为5TGGGAGCACGCT GCCTATGATGTC3,下游引物序列为5CCTTCGCT TCCACTCCACGAGCTC3，产物大小为610 bp4。作为内参照的actin上游引物序列为5CCCAGAG CAAGAGAGGTATC3，下游引物序列为5GACCA GAGGCATACAGGGAC3,产物大小267 bp5。PCR反应体系50 l，各成分按照Taq酶（Promega）使用说明配制。反应条件：95 5 min；94 30 s,60 30 s,72 1 min，共35个循环；72 10 min。PCR完成后产物行1.5琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相，凝胶分析软件分