抑制型电导和脉冲积分安培检测-离子色谱法测定

1、抑制型电导和脉冲积分安培检测-离子色谱法测定摘要：本文采用IonPac CS18，一种弱酸型阳离子交换柱，与抑制型电导检测、积分脉冲安培检测（IPAD）和紫外检测(UV)联用无需衍生测定肉和奶酪中的生物胺。CS18柱无需使用高浓度酸淋洗液和有机溶剂就可以分离生物胺，且同样可以保证洗脱相近峰如腐胺和尸胺的分离 关键词： 生物胺； 弱酸型阳离子交换柱；抑制型电导检测；积分脉冲安培检测（IPAD）；紫外检测(UV) 生物胺在人类和动物生理学功能上扮演着非常重要的角色，与食品腐败和安全直接相关。从常规饮食中摄入低量生物胺并不危险，但是若摄入量过高则会引起低血压（组胺、腐胺和尸胺）、高血压（酪胺）、偏头

2、痛（酪胺和苯乙胺）、恶心、皮疹、晕眩、心输出量增加，以及呼吸加速。食品在被食用前为了评估其潜在的健康隐患而进行生物胺的测定显得至关重要。 生物胺通常采用反相HPLC，UV或者荧光检测。由于绝大多数生物胺缺少合适的发光和荧光基团，所以需要进行柱前或柱后衍生后才能检测。最常用的衍生试剂包括丹磺酰氯、苯酰氯和o-苯二醛（OPA）。这些衍生步骤在耗费时间、人力的同时还导致了潜在的副产物干扰，使得胺的测得量或高或低。 本文采用IonPac CS18，一种弱酸型阳离子交换柱，与抑制型电导检测、积分脉冲安培检测（IPAD）和紫外检测(UV)联用无需衍生测定肉和奶酪中的生物胺。CS18柱无需使用高浓度酸淋洗液

3、和有机溶剂就可以分离生物胺，且同样可以保证洗脱相近峰如腐胺和尸胺的分离。温和的分离条件使得抑制型电导也可以检测许多未经衍生的生物胺。IPAD对抑制后缺少一个电荷的生物胺同样可以检测，此法已经应用于巧克力中生物胺的测定。UV则可用来确认与其它胺或氨基酸共淋洗的弱保留芳香生物胺的存在和浓度。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Dionex ICS-3000 系统；Chromeleon 6.7 色谱控制软件；搅拌器（家庭和工业强度型）；离心机（Beckman Coulter，Brea，CA）；涡流混合器（Fisher Scientific） 去离子水，I级纯，电阻率大于等于18Mcm； 氢氧化钠，5

4、0%（w/w）(Fisher Scientific，SS254-1)； 甲烷磺酸，99%（Dionex公司，P/N 033478） 1.2色谱条件 柱：IonPac CS18 Analytical，2250 mm (P/N 062878)；IonPac CG18 Guard,250 mm(P/N 062880)； 淋洗液*：06 min, 3 mM MSA；610 min，310 mM；1022 min, 1015 mM；2228 min, 15 mM；2835 min,1530 mM；35.145 min，3045 mM。 淋洗液源：EG淋洗液发生器单元； 流速：0.30 mL/min；进样

5、体积：5 L；温度：40（下温控室），30（上温控室）； 检测方式：* 抑制型电导， CSRS ULTRA (2 mm),外接水自抑制模式，电流设定为40mA，UV-Vis检测设置为276 nm；背景电导: 0.40.5 S； 电导噪音: 0.20.3 nS； 系统反压: 2500 psi 柱后加入法： 检测方式：积分脉冲安培法（IPAD），常规Au电极； 柱后试剂流速：100 mM NaOH，0.24 mL/min； IPAD背景：4050 nC； IPAD噪音：6070 pC (没装抑制器)，210 pC (装抑制器) 在进样前需先用3 mM MSA平衡柱子5min； 本注解中介绍了三种不

6、同的检测配置：IPAD,抑制型电导-IPAD和UV-IPAD 1.3样品前处理 取5 g基本样品到50 mL离心管中，并随后加入20 mL 100 mM MSA提取。使用涡流混合器混匀该混合物1 min，在转速6000 rpm 和4条件下离心20 min。倾出上清液，用0.2 m滤头过滤到50 mL容量瓶中。往离心管中再次加入20 mL MSA，重复进行萃取。上清液过滤到容量瓶中，并用去离子水稀释到刻度。在分析之前，提取液需要与去离子水1：1稀释。 猕猴桃和巧克力（70%可可） 猕猴桃和巧克力样品也是取5 g基本样品到50 mL离心管中，并随后加入10 mL 100 mM MSA提取。样品提取

7、如同菠菜中所提及，但是无需在测定前进行稀释。 黑巧克力和牛奶巧克力 取2 g基本样品到15 mL离心管中，并随后加入4 mL 100 mM MSA提取。使用涡流混合器混匀该混合物1 min，在转速6000 rpm 和4条件下离心30 min。倾出上清液，用0.2 m滤头分别过滤到容量瓶中，用离子水1：1稀释。 2结果和讨论 图1 生物胺的分离和检测(A. 抑制型电导，B. IPAD，C. 色胺使用UV检测)图1为生物胺的分离情况，以抑制型电导、积分脉冲安培和UV检测（为串接）。多巴胺、酪胺和色胺不能通过抑制型电导检测，因为他们在被抑制后缺少正电荷。因此，要检测10种生物胺就需要配合IPAD使用

8、。色胺的存在与否之前使用IPAD确定，而UV检测同样也可以验证其存在。 使用电解产生的MSA淋洗液可以简化方法，使得开发出分离目标生物胺最佳梯度的过程更加容易。电解产生淋洗液在之前的研究中还没有同IPAD一起使用过，因为MSA淋洗液产生过程中产生氧气。淋洗液中的溶解氧会对背景信号产生很大的变化，因此必须被脱除。通过使淋洗液通过EG脱气装置的淋洗液通道、而外接水则通过其Regen通道从而脱除掉氧气。由于背景不再出现反复无常的变化，说明EG产生的氧气已经被脱除。EG只需要添加去离子水而简化了方法开发，避免了手工离线配制淋洗液时产生的潜在错误和不一致。 图2 含有70%可可的巧克力生物胺IPAD测定

9、(A)未加标样品（B）加标样品浓度是按照稀释倍数1：22计算 菠菜叶中的生物胺浓度在4冰箱中贮藏3周后发生了很大的变化。亚精胺浓度从48.5降低到3.3 mg/kg，而组胺和精胺则完全降解（图3），61 mg/kg组胺的完全降解是一个很有意思的结果。为确保结果的准确性，样品只用IPAD进行重新测定，此法可以用于确认组胺的不存在。早期的研究结果标明在蔬菜产品在冰箱中保存三周后腐胺、亚精胺和精胺的浓度发生了改变。尽管Leuschner等证明某些微生物能够降解组胺，但是找不到任何相关蔬菜中组胺降解的数据。猕猴桃在4贮藏2周后，组胺大约降低了82%，亚精胺增加了25%，而精胺浓度则没有改变。贮藏之后猕猴桃中的组胺完全被降解。 图3 菠菜中生物胺分离和检测（A）IPAD(新鲜样品)和（B）抑制型电导（4下贮藏三周） 3 结论 多聚弱酸阳离子交换柱IonPac CS18可以用于分离各种食品样品中的生物胺，检测方式可以为IPAD、抑制型电导和UV。本方法使用简单的电化学产生的MSA淋洗液而无需使用溶剂和以前报道的腐蚀性淋洗系统。此外，本法适用于很多种样品基体，并具有很好的精确