植物表达载体构建

1、 第五节第五节 植物基因工程载体植物基因工程载体 在植物基因转化研究中已建立了多种转化系统，在植物基因转化研究中已建立了多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因直接导入转化系统、基因枪枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介导转化系统等等。导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。系统。 载体转化系统中最重要的又是载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。质粒转化载体。一植物基因工程载体种类及命名规

2、则：一植物基因工程载体种类及命名规则：二根癌农杆菌二根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能质粒的结构和功能：（一）（一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能：质粒的遗传特性、结构及功能： （二）（二）T-DNA的基因结构与功能：的基因结构与功能：三农杆菌三农杆菌Ti质粒的基因转化机理：质粒的基因转化机理： （一）（一）T-DNAT-DNA的加工和转移：的加工和转移： （二）（二）T链蛋白复合体的形成及链蛋白复合体的形成及VirE的功能：的功能： （三）（三）T链复合体通过细菌膜的转运及链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能：的功能： （四）（四）T链复合体靶向植物细胞核：链复合体靶向植物细胞核： （五）（

3、五）T链整合植物基因组的分子机理：链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对（六）农杆菌染色体基因对T-DNAT-DNA转移的调控：转移的调控：四四农杆菌农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建：质粒的改造及载体构建：（一）（一）TiTi质粒的改造及卸甲载体构建：质粒的改造及卸甲载体构建： （二）（二）中间载体的构建：中间载体的构建： （三）（三）中间表达载体的构建：中间表达载体的构建： （四）（四）植物基因转化载体系统的构建：植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因（五）载体构建中常用的选择基因和报告基因（五）（五）T链整合植物基因组的分子机理：链整合植物

4、基因组的分子机理：1整合位点及其特性：整合位点及其特性： 遗传作图的分析表明，遗传作图的分析表明，T-DNA在植物染色体上的插在植物染色体上的插入是随机的，可插入任何一条植物染色体。但插入位点入是随机的，可插入任何一条植物染色体。但插入位点常有以下特点：常有以下特点：T-DNAT-DNA优先整合到转录活跃的植物基优先整合到转录活跃的植物基因位点；因位点；T-DNAT-DNA与植物与植物DNADNA连接处富含连接处富含A A、T T碱基对；碱基对；植物植物DNADNA上的插入靶位点与上的插入靶位点与T-DNAT-DNA边界序列有一定程度的边界序列有一定程度的同源性。同源性。Matsumoto等人

5、认为，正是由于这种同源性才等人认为，正是由于这种同源性才使得插入的使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生和靶序列能互相靠近，并有效地发生DNA链的交换。链的交换。 在在T-DNA的整合过程中还常发现植物基因组靶序列的整合过程中还常发现植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，说明的缺失、倒位和重复等现象，说明T-DNA的整合过程依的整合过程依赖于植物内源重组系统。赖于植物内源重组系统。（五）（五）T链整合植物基因组的分子机理：链整合植物基因组的分子机理：1整合位点及其特性整合位点及其特性2T-DNA整合的遗传效应整合的遗传效应：位点效应：位点效应：T-DNA可插入多个物理位点。遗

6、传位点数一般少可插入多个物理位点。遗传位点数一般少于或等于插入的物理位点数，这是因为甲基化可使基因不表于或等于插入的物理位点数，这是因为甲基化可使基因不表达；或者，多拷贝插入不同位点或首尾串联在一起，可能相达；或者，多拷贝插入不同位点或首尾串联在一起，可能相互 起 作 用 而 导 致 基 因 的 沉 默 （ 被 称 为 共 抑 制 ，互 起 作 用 而 导 致 基 因 的 沉 默 （ 被 称 为 共 抑 制 ， c o -suppression）。）。 T-DNA的插入一般不引起植物的插入一般不引起植物DNA大的重排，但多数插入大的重排，但多数插入会导致靶位点处出现小的缺失，缺失多的可达会导致

7、靶位点处出现小的缺失，缺失多的可达79个核苷酸。个核苷酸。在在T-DNA/植物植物DNA连接处，有几个至连接处，有几个至33个核苷酸的个核苷酸的“填填充充”DNA（Filler DNA）的存在，这些填充）的存在，这些填充DNA的序列与靠的序列与靠近连接处的植物近连接处的植物DNA序列相似。序列相似。 在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和两端和植物靶位处之间有一段序列（植物靶位处之间有一段序列（5-10bp）同源，则可在整合中）同源，则可在整合中起作用。起作用。（六）农杆菌染色体基因对（六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控：转移的调控

8、： 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与T-DNA的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。ChrA、ChrB和和ChrC均参与细菌的附着功能。还有一些均参与细菌的附着功能。还有一些基因（基因（Cel、Att、ivr、PscA和和ExoC等）在等）在T-DNA转移转移中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外，变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外，ChrD位点影响位点影响AS对毒性区的诱导

9、效率和农杆菌的致瘤对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤能力。这是因为能力。这是因为ChrD可能编码一种细菌可能编码一种细菌ATP结合蛋白，结合蛋白，在低在低pH值和磷酸饥饿的情况下可诱导值和磷酸饥饿的情况下可诱导VirG的表达。的表达。ChrE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响Vir区的区的表达有关。表达有关。Ros基因与基因与Vir基因的负调节有关。可见，目基因的负调节有关。可见，目前已知农杆菌染色体上游前已知农杆菌染色体上游10个基因与个基因与T-DNA的转移有关。的转移有关。四四农杆菌农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建质粒的改造及载体构建（一）（一）Ti

10、Ti质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建（二）中间载体的构建（二）中间载体的构建（三）（三）中间表达载体的构建中间表达载体的构建（四（四）植物基因转化载体系统的构建植物基因转化载体系统的构建（五）载体构建中常用的选择基因和报告基因（五）载体构建中常用的选择基因和报告基因（一）（一）TiTi质粒的改造及卸甲载体构建：质粒的改造及卸甲载体构建： 由于大肠杆菌具有能与农杆菌高效接合转移的特性，由于大肠杆菌具有能与农杆菌高效接合转移的特性，科学家们可以先把科学家们可以先把T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农并插

11、入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的杆菌的Ti质粒上。带有重组质粒上。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒称为中的大肠杆菌质粒称为中间载体（间载体（intermediate vector），而接受中间载体的），而接受中间载体的Ti质质粒称为受体粒称为受体Ti质粒（质粒（acceptor Ti plasmid），一般是卸甲），一般是卸甲载体（载体（disarmed vector）。）。卸甲载体卸甲载体（disarmed vector）1Onc-卸甲载体：卸甲载体：所谓的卸甲载体就是无毒的（所谓的卸甲载体就是无毒的（non-oncogenic）、即切）、即切除了除了Onc致瘤基因的致瘤

12、基因的Ti质粒载体。在这种质粒载体。在这种Onc-载体中，已载体中，已经缺失的经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取取代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都片段，都可以通过与可以通过与pBR322质粒质粒DNA的同源重组，而被共整合到的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。最常用的质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为卸甲载体为pGV3850，它保留了两个边界和右边界附近的它保留了两个边界和右边界附近的nos基因（胭脂碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记；基

13、因），可作为鉴别转化细胞的一个标记；T-DNA内部的内部的 Onc缺失区被缺失区被pBR322序列（含序列（含Apr基因）所取代。插入基因）所取代。插入pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成共和体，即重组体。共和体，即重组体。2. Onc+卸甲载体：卸甲载体：不去除不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。基因的卸甲载体，用于特殊用途。四四农杆菌农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建质粒的改造及载体构建 （一）（一）TiTi质粒的改造及卸甲载体构建：质粒的改造及卸甲载体构建：（二）（二）中间载体中间载体的构建：的构建：1中间载体的基本结构

14、与特点中间载体的基本结构与特点2常用的中间载体及其构建常用的中间载体及其构建1中间载体的基本结构与特点：中间载体的基本结构与特点： 为解决为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中间载体是有效方法之一。中间载体是在大肠杆菌的克隆间载体是有效方法之一。中间载体是在大肠杆菌的克隆载体（例如载体（例如pBR322质粒）中插入一段合适的质粒）中插入一段合适的T-DNA片段片段而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质小质粒。粒。从结构特点上看，中间载体可分为两类：从结构特点上看，中间载体可分为两类：共整合

15、系统中间载体共整合系统中间载体双元载体系统中间载体双元载体系统中间载体（1）共整合系统中间载体共整合系统中间载体：含有与含有与Ti质粒质粒T-DNA区同源的区同源的序列，此外含有序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频的序列，在其被引入农杆菌后即可高频地与地与Ti质粒的质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个的同源序列进行重组；具有一个或多个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有bom位点位点（接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，（接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点位点的存在可使中间载体在不同细菌

16、细胞内进行转移；含有植物的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基）基因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；无切点，以利于外源基因的插入；无Ti质粒的边界序列质粒的边界序列(见下见下图图)。（2）双元载体系统中间载体双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处：其与共整合载体的不同之处是

17、：无同源序列；具有是：无同源序列；具有LB和和RB；无；无ColE复制点。复制点。2常用的中间载体及其构建：常用的中间载体及其构建：（1）广谱中间载体广谱中间载体：所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆T-DNA片段后片段后构建而成的。常用的广谱质粒是构建而成的。常用的广谱质粒是RK2衍生的载体衍生的载体pRK290。由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制。中复制。广谱中间载体的构建过程见下图。广谱中间载体的构建过程见下图。将选定的将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上；片段克

18、隆到大肠杆菌质粒上；将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入到到T-DNA片段的限制性切点中；片段的限制性切点中；将产生的将产生的T-DNA“工程工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒片段亚克隆或共整合到广谱质粒pRK290。由于由于pRK290具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点，具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点，因而在辅助质粒如因而在辅助质粒如pRK2013反式动员作用下，反式动员作用下，pRK290即可即可从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。（2）pBR322衍生的中间载体：衍生的中间载体： 这类中间载体

19、含有这类中间载体含有pBR322质粒的部分序列，是质粒的部分序列，是由由pBR322质粒或其衍生质粒亚克隆质粒或其衍生质粒亚克隆T-DNA片段而形片段而形成。其构建方法类似于上述广谱中间载体。由于成。其构建方法类似于上述广谱中间载体。由于pBR322质粒上带有质粒上带有pMB1的的bom转移接合位点，因而转移接合位点，因而在辅助质粒如在辅助质粒如R64drd11的帮助下，这种的帮助下，这种pBR322衍生衍生的中间载体能够导入农杆菌中的的中间载体能够导入农杆菌中的Ti质粒。质粒。pBR322质质粒只有与粒只有与Ti质粒重组后得以生存，未重组的质粒重组后得以生存，未重组的pBR322不能在根癌农

20、杆菌中复制而自行消失。不能在根癌农杆菌中复制而自行消失。（三）（三）中间表达载体中间表达载体的构建：的构建：中间载体从功能上看可分为两大类：克隆中间载体从功能上看可分为两大类：克隆载体和表达载体。载体和表达载体。克隆载体的主要功能是复制和扩增基因；克隆载体的主要功能是复制和扩增基因；表达载体是适于在受体细胞中表达外源基表达载体是适于在受体细胞中表达外源基因的载体。因的载体。中间表达载体含有植物特异启动子，因而中间表达载体含有植物特异启动子，因而能在植物中表达外源基因能在植物中表达外源基因。（三）中间表达载体的构建（三）中间表达载体的构建1启动子及其它调控序列：启动子及其它调控序列： 转录的调控

21、对真核生物基因表达起着关键的作用。大多转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多数真核生物在转录起始点的数真核生物在转录起始点的5端上游区第端上游区第30至至25bp处具有处具有TATA盒，在盒，在70至至80bp处还有处还有CAAT盒；盒；3端具有端具有AATAA序序列。列。Ti质粒的质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动等基因都具有与真核生物启动子类似的子类似的TATA盒和盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，且盒，均能在植物细胞中表达，且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以其中以Nos启动

22、子（启动子（pNos）最常用。后来发现，由）最常用。后来发现，由CaMV35s启动子、外源结构基因和启动子、外源结构基因和Nos 3端的非编码区域组成的嵌合端的非编码区域组成的嵌合基因，能在植物细胞中高效表达。基因，能在植物细胞中高效表达。CaMV35s启动子既无组启动子既无组织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基因工程启动子。因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用于各种不同的转化目的。于各种不同的转化目的。2嵌合基因嵌合基因（chimeric gene）

23、构建：）构建： 所谓嵌合基因就是所谓嵌合基因就是来自两种或两种以上生物的启动来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因连接在一起而构成的基因子、结构基因连接在一起而构成的基因。 3中间表达载体的构建过程：中间表达载体的构建过程： 中间表达载体是由中间载体加上能在植物细中间表达载体是由中间载体加上能在植物细胞中表达的启动子和选择标记基因构成，也就是胞中表达的启动子和选择标记基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。所以中间载体的嵌合基因插入中间载体后构成。所以中间载体的构建是一个十分复杂的过程。构建是一个十分复杂的过程。（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建： 上述构

24、建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体TiTi质粒质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统。复合型载体，故称之为载体

25、系统。 目前采用的主要有两种载体系统：目前采用的主要有两种载体系统：一元载体系统一元载体系统和和双元载体系统双元载体系统。（四）植物基因转化载体系统的构建：（四）植物基因转化载体系统的构建：1一元载体系统的构建：一元载体系统的构建： 这类载体是中间表达载体与改造后的受体这类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共共整合载体整合载体（co-integrated vector，cis），由于该载体的），由于该载体的T-DNA区与区与Ti质粒质粒Vir区连锁，因此又称为顺式载体（区连锁，因此

26、又称为顺式载体（cis-vector）。）。 一元载体的特点是：一元载体的特点是：由两个质粒（由两个质粒（E.Coli质粒和质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；质粒）重组而成，分子量较大；共整合体的形成频共整合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关，相对较低；率与两个质粒的重组频率有关，相对较低；必须用必须用Southern杂交或杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；对大的共整合体质粒进行检测；构建时比较困难。构建时比较困难。 一元载体系统目前主要有两种：共整合载体和一元载体系统目前主要有两种：共整合载体和拼接末拼接末端载体端载体（split-end vector，SEV）。）。（四）植物基

27、因转化载体系统的构建：（四）植物基因转化载体系统的构建： 1一元载体系统的构建：一元载体系统的构建： （1）共整合载体共整合载体的构建：的构建：共整合载体的特点：共整合载体的特点：中间表达载体与受体中间表达载体与受体Ti卸甲载体通过同源重组共整合而成；卸甲载体通过同源重组共整合而成；共整合载体与受体共整合载体与受体Ti质粒之间的同源序列是质粒之间的同源序列是pBR322。以以pGV3850为例说明其构建过程（图）：为例说明其构建过程（图）： 第一步：中间载体导入农杆菌第一步：中间载体导入农杆菌 接合转移法和三亲杂交转移法接合转移法和三亲杂交转移法 第二步：中间载体与受体第二步：中间载体与受体T

28、i质粒的同源重组：质粒的同源重组： 第三步：共整合载体的选择：第三步：共整合载体的选择： （1）共整合载体的构建）共整合载体的构建第一步：中间载体导入农杆菌：通常有两种方法第一步：中间载体导入农杆菌：通常有两种方法:即接合转移法（即接合转移法（conjugative transfer）和三亲杂交转移法。）和三亲杂交转移法。1）接合转移法接合转移法是由于大肠杆菌质粒衍生出来的中间表达载体是由于大肠杆菌质粒衍生出来的中间表达载体均为接合缺陷型（非接合型），不能自主转移，只有在具均为接合缺陷型（非接合型），不能自主转移，只有在具有接合转移功能的协助质粒存在时才能被动地完成转移。有接合转移功能的协助质

29、粒存在时才能被动地完成转移。根据中间载体是否有根据中间载体是否有recA依赖性重组和协助质粒本身是否依赖性重组和协助质粒本身是否转移，可将中间载体的接合转移分为传导（转移，可将中间载体的接合转移分为传导（conduction）和供给（和供给（donation）两种类型。）两种类型。传导传导：特点是依赖：特点是依赖recA介导的重组，协助质粒本身也从大肠杆菌转移介导的重组，协助质粒本身也从大肠杆菌转移到农杆菌，转化效率低；到农杆菌，转化效率低；供给供给：既不依赖于：既不依赖于recA介导重组，协助质粒也不从大肠杆菌转移到农介导重组，协助质粒也不从大肠杆菌转移到农杆菌，然而其转化效率很高，又被称为

30、杆菌，然而其转化效率很高，又被称为“动员动员”（mobilization）。）。pBR322属于属于ColEI型的、无自我传递功能的质粒。型的、无自我传递功能的质粒。2）三亲杂交转移法三亲杂交转移法（triparental mating）：）：第一步：中间载体导入农杆菌第一步：中间载体导入农杆菌 （1）接合转移法（）接合转移法（conjugative transfer）（2）三亲杂交转移法（）三亲杂交转移法（triparental mating）：）： 上述接合转移法是先将中间载体的上述接合转移法是先将中间载体的DNA转化到带有协助转化到带有协助质粒的大肠杆菌菌株上，然后再与带有受体质粒的大肠

31、杆菌菌株上，然后再与带有受体Ti质粒的农杆菌接质粒的农杆菌接合，整个过程比较复杂。近年来新发展起来的三亲杂交法则比合，整个过程比较复杂。近年来新发展起来的三亲杂交法则比较简便有效。就是将三种有关的菌株混合培养进行杂交。较简便有效。就是将三种有关的菌株混合培养进行杂交。这三种菌株是：这三种菌株是：含有协助质粒的大肠杆菌菌株（如含有协助质粒的大肠杆菌菌株（如pG23中含有的中含有的pGJ28质粒和质粒和R64dRd11质粒）；质粒）；含有重组的中间载体的大肠杆菌菌株（如含有重组的中间载体的大肠杆菌菌株（如pLGV1103中含中含有有pBR322）；）；含有受体含有受体Ti质粒的农杆菌菌株，如质粒的

32、农杆菌菌株，如pGV3850。 在混合培养的过程中，通过杂交使协助质粒先转移到含有在混合培养的过程中，通过杂交使协助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中，然后中间载体再被动员和转移到农杆重组中间载体的菌株中，然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中。菌中。（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建：（1）共整合载体的构建共整合载体的构建 第一步：中间载体导入农杆菌第一步：中间载体导入农杆菌第二步：中间载体与受体第二步：中间载体与受体TiTi质粒的同源重组：质粒的同源重组： pLGV1103pLGV1103中间表达载体导入农杆菌后，由于两中间表达载体导入农杆菌后，由于两种质粒

33、中都带有种质粒中都带有pBR322pBR322同源序列，因此少部分质同源序列，因此少部分质粒发生重组和交换，使少数中间载体整合到粒发生重组和交换，使少数中间载体整合到pGV3850pGV3850的的T-DNAT-DNA区域中，形成一个大的共整合载区域中，形成一个大的共整合载体。该共整合载体的基因结构及酶切图如下：体。该共整合载体的基因结构及酶切图如下：（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建：（1）共整合载体的构建共整合载体的构建第一步第一步：中间载体导入农杆菌第二步：中间载体与受体Ti质粒的同源重组第三步：共整合载体的选择第三步：共整合载体的选择： 通过通过pGV3

34、850和和pLGV1103质粒同源重组形成的共整合载质粒同源重组形成的共整合载体能够不断复制和增殖，整合在体能够不断复制和增殖，整合在Ti质粒中的中间载体随同质粒中的中间载体随同Ti质质粒得到复制和增殖。中间载体所带有的粒得到复制和增殖。中间载体所带有的Apr（氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性基因）、基因）、Knr（卡那霉素抗性基因）和（卡那霉素抗性基因）和Smr或或Str（链霉素抗性（链霉素抗性基因）都能得到表达。此时含有共整合质粒的农杆菌将表现基因）都能得到表达。此时含有共整合质粒的农杆菌将表现出中间载体携带的抗性标记，从而在含有抗菌素的培养基上出中间载体携带的抗性标记，从而在含有抗菌素的培

35、养基上被保留和生长。未发生重组的被保留和生长。未发生重组的pGV3850和和pLGV1103等均不能等均不能生长，因为生长，因为pBR衍生质粒的复制属于衍生质粒的复制属于ColEI类型，在农杆菌细类型，在农杆菌细胞内不能自我复制，因不能稳定存在而消失。胞内不能自我复制，因不能稳定存在而消失。含有共整合质含有共整合质粒的农杆菌即可用于植物的转化。粒的农杆菌即可用于植物的转化。（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建： 1一元载体系统的构建：一元载体系统的构建： （1）共整合载体的构建）共整合载体的构建（2）SEV的构建的构建： 即即T-DNA边界拼接系统，亦称拼接末端载

36、体边界拼接系统，亦称拼接末端载体（split-end vector，SEV），是另一种共整合载体。），是另一种共整合载体。因为它的两个因为它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。质粒上而得名。其构建过程如下图。其构建过程如下图。SEV的构建过程：的构建过程：1）SEV的受体的受体Ti质粒是质粒是pTiB6S3-SE，来自野生型质粒，来自野生型质粒pTiB6S3的突变体。的突变体。它的它的TL-DNA上的致瘤基因（上的致瘤基因（onc）及）及TR都已经缺失，都已经缺失，T-DNA的保留部分的保留部分被称为被称为“左边界内部同源区左边界内部同源区”（le

37、ft inside homcology，LIH），即左边界），即左边界内部同源序列。该受体内部同源序列。该受体Ti质粒还保留了质粒还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因（时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因（Knr）。）。2）SEV中间载体是中间载体是pMon200或或pMon120。它含有一个胭脂碱合成酶基因，。它含有一个胭脂碱合成酶基因，一个在细菌里编码的壮观酶素抗性基因（一个在细菌里编码的壮观酶素抗性基因（Spcr）、链霉素抗性基因）、链霉素抗性基因Strr和和Npt-II基因，特别是它具有与受体基因，特别是它具有与

38、受体Ti质粒同源的质粒同源的LIH序列及序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体）通过三亲杂交将中间载体pMon200导入农杆菌后，由于它们之间都具有导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序列，即可发生同源重组，形成同源序列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。的共整合载体。SEV包含有包含有分别来自两个质粒的左右边界及分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因基因，成为一个完整的非致瘤性，成为一个完整的非致瘤性Ti质粒。质粒。由于由于pMon200中间载体带有抗性嵌合基因，因而转化的植物可以直接进行中间载体带有抗性嵌合基因，因而转化的植物可以直接进行筛选。筛选。（3）SEV和和pGV38

39、50的比较：的比较： 两者都是通过受体两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，同属质粒与中间载体同源重组而形成，同属于共整合的一元载体系统，但它们之间有一定差异：于共整合的一元载体系统，但它们之间有一定差异：1）它们的受体）它们的受体Ti质粒和中间载体的结构不同。质粒和中间载体的结构不同。pGV3850的左的左右边界在一个受体右边界在一个受体Ti质粒上，而质粒上，而SEV来自两个质粒，即来自两个质粒，即TR来自中间载体。来自中间载体。2）同源序列不同。）同源序列不同。pGV3850重组的同源序列是重组的同源序列是 pBR322，而，而SEV是是LIH。3）SEV是更有效的共整合载体。

40、由于是更有效的共整合载体。由于pGV3850 共整合载体共整合载体带有大肠杆菌带有大肠杆菌pBR322序列，外源基因嵌合在该序列中，序列，外源基因嵌合在该序列中，因而转化的植物中也带有重复的因而转化的植物中也带有重复的 pBR322序列。序列。此重复序此重复序列可能对转化植物中外源基因的稳定性有影响，而列可能对转化植物中外源基因的稳定性有影响，而SEVSEV系系统则排除了这种可能性统则排除了这种可能性。（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建： 1一元载体系统的构建一元载体系统的构建2双元载体系统的构建：双元载体系统的构建：双元载体（双元载体（binary vecto

41、r）系统是指由两个分别）系统是指由两个分别含含T-DNA和和Vir区的相容性突变区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒构成的双质粒系统，也因为其质粒系统，也因为其T-DNA与与Vir基因在两个独基因在两个独立的质粒上立的质粒上，通过反式激活，通过反式激活T-DNA转移，故又转移，故又称为称为反式载体反式载体（trans vector）。）。（1）双元载体系统的构建原理：）双元载体系统的构建原理： Ti质粒上的质粒上的Vir基因与基因与T-DNA具有反式互补作用，即具有反式互补作用，即Vir基因可以反式激活基因可以反式激活T-DNA的转移。根据这一原理可以使的转移。根据这一原理可以使T-DNA与与V

42、ir区处于不同的复制子或不同的区处于不同的复制子或不同的Ti质粒中，同样可质粒中，同样可以激活以激活T-DNA的转移，使插入到的转移，使插入到T-DNA区的外源基因导入区的外源基因导入到植物细胞中；其次，双元载体含有广泛寄主范围质粒的到植物细胞中；其次，双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点（复制起始点（oriv），从而替代了在共整合载体中用以重组），从而替代了在共整合载体中用以重组的同源区。它们能够在任何农杆菌寄主里自发复制，这意的同源区。它们能够在任何农杆菌寄主里自发复制，这意味着所有的农杆菌菌株不论它带有味着所有的农杆菌菌株不论它带有Ti质粒还是质粒还是Ri质粒，不论质粒，不论它是武装

43、的还是解除武装的，都能导入中间载体成为双元它是武装的还是解除武装的，都能导入中间载体成为双元载体，寄主仅需要一套完整的载体，寄主仅需要一套完整的Vir基因。基因。 双元载体主要包括两个双元载体主要包括两个TiTi质粒，即微型质粒，即微型TiTi质粒和辅助质粒和辅助TiTi质粒。质粒。 （2）微型微型Ti质粒质粒（mini-Ti plasmid）：）：所谓微型所谓微型Ti质粒就是质粒就是含有含有T-DNA边界、缺失边界、缺失Vir基因的基因的Ti质粒质粒，因而转化的植物不会产生肿瘤。因而转化的植物不会产生肿瘤。Mini-Ti是一个广谱质粒，除含有是一个广谱质粒，除含有T-DNA左右边界外，还左右

44、边界外，还具有广谱质粒的复制起始点具有广谱质粒的复制起始点OriV及选择标及选择标记基因。记基因。Mini/PRK的复制原点来自的复制原点来自pRK290，pAL1050复制原点复制原点来自来自pRm，Bin6、Bin9等均含有等均含有pRK252的复制原点。的复制原点。Bin19是应用得最广泛的是应用得最广泛的Mini-Ti（下图）。它含有来自（下图）。它含有来自pTiT37的的T-DNA左右边界序列，在两个边界序列之间左右边界序列，在两个边界序列之间T-DNA区含有植物选择标记区含有植物选择标记Npt-II基因，基因，以及来自噬菌体以及来自噬菌体M13mp19的多种酶连接接头的的多种酶连接

45、接头的LacZ基因。在基因。在LacZ基因内部含基因内部含有多克隆位点，外源基因可以便利地插入其间使其本身失活。此外，含有广寄有多克隆位点，外源基因可以便利地插入其间使其本身失活。此外，含有广寄主质粒主质粒Rk2的复制和转移起始位点。总之，的复制和转移起始位点。总之，Bin19具有质粒小、宿主广、带有具有质粒小、宿主广、带有LacZ基因和基因和EcoRI、BamHI、Hind、SstI、KpnI、SmaI、XbaI及及SalI等单一等单一限制性内切酶切点组成的多用接头等优点，故外源基因较易插入，并且可在含限制性内切酶切点组成的多用接头等优点，故外源基因较易插入，并且可在含X-gal（5-bro

46、mo,4-chloro,3-indoly,1-D-galactopyronoside，5溴溴-4-氯氯-3-吲哚呋吲哚呋喃半乳糖苷）和喃半乳糖苷）和IPTG（isopripy, 1-D-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷），异丙基硫代半乳糖苷）的平板上直接进行筛选，操作极为方便。的平板上直接进行筛选，操作极为方便。（四）（四）植物基因转化载体系统植物基因转化载体系统的构建：的构建：1一元载体系统的构建一元载体系统的构建2双元载体系统的构建双元载体系统的构建（3）辅助）辅助Ti质粒：质粒： 含有含有Vir区段的区段的Ti质粒称为辅助质粒称为辅助Ti质粒。实际上辅助质粒。实际上辅助

47、Ti质质粒是粒是T-DNA缺失的突变型缺失的突变型Ti质粒，完全丧失了致瘤功能，因此质粒，完全丧失了致瘤功能，因此是相当于在共整合载体系统中的卸甲是相当于在共整合载体系统中的卸甲Ti质粒（质粒（Disarmid Ti）。）。其主要作用是提供其主要作用是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移，该卸甲载体在此又称为辅助质粒（转移，该卸甲载体在此又称为辅助质粒（helper Ti）。）。一一元载体系统提供的辅助质粒的作用是提供诱导接合质粒转移的元载体系统提供的辅助质粒的作用是提供诱导接合质粒转移的Tra和和Mob功能，不能混淆功能，不能混淆。 最常用的辅

48、助最常用的辅助Ti质粒是根癌农杆菌质粒是根癌农杆菌LBA4404所含有的所含有的Ti质质粒粒pAL4404。其为章鱼碱型。其为章鱼碱型Ti质粒质粒pTiAch5的衍生质粒，其的衍生质粒，其T-DNA区已发生缺失突变，但仍保存有完整的区已发生缺失突变，但仍保存有完整的Vir基因功能。近基因功能。近年来的研究表明，野生型的年来的研究表明，野生型的Ti质粒即不卸甲的质粒即不卸甲的Ti质粒，同样可质粒，同样可以作为辅助以作为辅助Ti质粒，而且具有更强毒性。质粒，而且具有更强毒性。（四）植物基因转化载体系统的构建：（四）植物基因转化载体系统的构建：1一元载体系统的构建一元载体系统的构建2双元载体系统的构

49、建双元载体系统的构建 （4）双元载体的构建：）双元载体的构建： 将将Mini-Ti质粒转入质粒转入Helper Ti质粒根癌农杆菌的途质粒根癌农杆菌的途径有两条，一条是径有两条，一条是直接用纯化的直接用纯化的Mini-Ti质粒转化速冻质粒转化速冻的根癌农杆菌感受细胞的根癌农杆菌感受细胞；另一条是与共整合载体构建一；另一条是与共整合载体构建一样，采用样，采用三亲接合三亲接合的方式。的方式。 Mini-Ti质粒均能以质粒均能以E.cili的的pRk2031为辅助质粒，为辅助质粒，通过通过三亲杂交三亲杂交而接合转移到含有辅助而接合转移到含有辅助Ti质粒的农杆菌细质粒的农杆菌细胞内。由于胞内。由于E.

50、coli pRk2031不能在农杆菌中复制而最后不能在农杆菌中复制而最后消失，含有消失，含有Mini-Ti质粒和质粒和Helper Ti质粒的根癌农杆菌质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化。可直接用于植物细胞的转化。（5）一元载体系统和双元载体系统的比较：）一元载体系统和双元载体系统的比较：1）双元载体系统中的两个质粒不必含有同源序列；）双元载体系统中的两个质粒不必含有同源序列；2）Mini-Ti质粒具有质粒具有E.coli质粒的复制其始点，能在农杆菌的寄主中复制，质粒的复制其始点，能在农杆菌的寄主中复制，而且，而且，Mini-Ti质粒分子量小（质粒分子量小（10kb），较易直接进行体外遗

51、传操作；），较易直接进行体外遗传操作；3）双元载体不需要经过两个质粒的共整合过程，构建的操作步骤较简单；）双元载体不需要经过两个质粒的共整合过程，构建的操作步骤较简单；4）Mini-Ti质粒较小，因此质粒转移到农杆菌比较容易，构建频率较高；质粒较小，因此质粒转移到农杆菌比较容易，构建频率较高；5）由于根癌农杆菌感染的寄主范围是由）由于根癌农杆菌感染的寄主范围是由Vir基因及染色体上的基因决定的，基因及染色体上的基因决定的，因此，使用双元载体系统更便于根据转化材料的来源不同选择适宜的因此，使用双元载体系统更便于根据转化材料的来源不同选择适宜的Helper系统；系统；6）双元载体在外源）双元载体在

52、外源DNA转入植物细胞前，无需进行同源重组，插入载体转入植物细胞前，无需进行同源重组，插入载体的外源基因变异可能要比的外源基因变异可能要比pGV3850系统来得小；系统来得小；7）共整合载体系统比双元载体系统更难以应用，通常一个共整合载体在用）共整合载体系统比双元载体系统更难以应用，通常一个共整合载体在用于植物转化之前，应弄清于植物转化之前，应弄清Ti质粒的拷贝数和大小，所以必须通过质粒的拷贝数和大小，所以必须通过Southern杂交来鉴定；杂交来鉴定；8）共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较好，）共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较好，双元载体稳定性较差双元载体稳定性较差，容易丢失；容易

53、丢失；9）双元载体在外源基因向植物的转化中效率高于共整合载体。）双元载体在外源基因向植物的转化中效率高于共整合载体。（五）载体构建中常用的（五）载体构建中常用的选择基因选择基因和和报告基因报告基因作为一种标记基因，必须具备作为一种标记基因，必须具备4个条件：个条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶； 基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因； 能在转化体中得到充分表达；能在转化体中得到充分表达； 检测容易，并能定量分析。检测容易，并能定量分析。 标记基因分为两种：选择标记基因和筛选标记基因。标记基因分为两种：选择标记基因和筛选标记基因。选择标记

54、基因选择标记基因的功能是该基因的产物对植物细胞产生一种的功能是该基因的产物对植物细胞产生一种选择压力，使未转化的细胞不能生长、发育与分化；而转选择压力，使未转化的细胞不能生长、发育与分化；而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长，从而将转化细化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长，从而将转化细胞选择出来。胞选择出来。筛选标记基因筛选标记基因则强调给转化细胞带上一种标记，起报告与则强调给转化细胞带上一种标记，起报告与识别作用，故称报告基因。识别作用，故称报告基因。1选择标记基因的应用及原理：选择标记基因的应用及原理： 一般采用的选择标记基因都是一般采用的选择标记基因都是低毒性化合物，抑低毒性化合物，抑制植物细胞的生长但不杀死细胞制植物细胞的生长但不杀死细胞。当采用高毒性化合。当采用高毒性化合物时，细胞将很快死亡；物时，细胞将很快死亡；死亡的或将要死亡的细胞对死亡的或将要死亡的细胞对临近的细胞会产生抑制作用，即使邻近细胞是转化细临近的细胞会产生抑制作用，即使邻近细胞是转化细胞也会受到某种抑制胞也会受到某种抑制。其次，选择标记对转化细胞生。其次，选择标记对转化细胞生长和器官分化能力会有一定影响；而且，一种选择标长和器官分化能力会有一定影响；而且，一种选择标记对不同作物的细胞影响不同，这是值得注意的。此记对不同作物的细胞影响不同，这是值得注意的。此外，选择标记在用于检验转化效果时，应该