第2章组织细胞培养技术文档资料

1、 组织培养(tissue culture)指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体（explants）接种到人工培养基，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程，也称为离体培养（in vitro culture）。一、概念根据接种外植体不同，分为：茎尖培养 (shoot tip culture)胚胎培养 (embryo/ovule/ovary culture)花药/花粉培养（anther/pollen/microspore culture）器官培养 (organ culture)组织或愈伤组织培养 (tissue or callus culture)

2、细胞/原生质体培养 (cell/protoplast culture)根据培养过程：l将从植株体上分离下来的第一次培养称为初代培养 (primary culture)l以后培养体转移到的培养基，则统称为继代培养 (subculture)根据培养方式：l将加琼脂的培养基称为固体培养基 (solid medium)l不加琼脂的培养基称 为 液 体 培 养 基 (liquid medium )1. 愈伤组织培养（callus culture）：植物各种器官或组织增殖而成的细胞团的培养。利用愈伤组织培养，在理论上可以阐明植物细胞的全能性和形态发育的可塑性，还可以诱导产生不定芽或胚状体而形成植株。2.

3、器官培养(organ culture)：主要是根端、茎尖、叶与未成熟果实等培养。根端的离体培养是研究生物合成的和一种手段，茎尖培养具有快速繁殖和去除病毒的优点。3. 胚培养(embryo culture)：主要是对较小且未成熟的胚进行培养，研究胚胎的发生以及影响胚生长的因素，特别是所需有机营养成分的研究。4.胚珠和子房培养(ovule and ovary culture)：培养已传粉的子房及胚珠，是进行试管受精和诱导单倍体植株的一个途径，也是研究生殖生理的有效方法。l5胚乳培养 (endosperm culture)是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系以及获得无籽结实的三倍体植株的手段。l6花粉和

4、花药培养 (pollen / anther culture)：利用花粉具有整套染色体的特点，诱导产生单倍体植株进行育种，可以缩短育种周期，获得纯系。7细胞培养 (cell culture)：分散性好的离体细胞或细胞团的培养，可应用于生产提取某些有用成分和次生物质，单细胞培养还可用于取得单细胞无性系，进行突变体选育。8. 原生质体培养 (protoplast culture)：将去壁后裸露的原生质体进行培养。易于摄取外来遗传物质，细胞器及病毒、细菌，应用于体细胞杂交或外源基因的导入研究。哪些过程涉及减数分裂和遗传重组与分离？ 哪些材料培养获得的组培苗有童期？ 园艺植物组织培养的意义和应用营养生理

5、细胞生理和代谢基因重组新的技术手段生物合成l加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。l克服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。l获得三倍体。l快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。l获得无病毒苗木。lin vitro (cryo-) preservation of germplasm1902年，植物生理学家（德），根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完全植株的潜在能力。lthe father of plant tissue cult

6、ure is considered to be the german botanist haberlandt who conceived the concept of cell culture in 1902. l1934年，white利用藻类用的无机盐培养基加上葡萄糖和酵母，建立了番茄离体根无性繁殖系。l1934年，guillarmond（法）的学生，gantheret，利用山毛柳、黑杨形成层组织培养。l1937年, white发现vb簇对根生长重要。 四十年代-lskoog&崔澂，腺嘌呤或腺苷可诱导形成芽。 五十、六十年代-lmorel&martin从受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。l

7、muir单细胞培养。 七十年代-l原生质体培养和体细胞杂交。l原核生物噬菌体在寄主大肠杆菌中复制 dna，得到遗体稳定的突变dna克隆。 八十年代-l转基因技术迅速发展，全球已有12种作物的48种转基因作物产品获准进行商品化生产，至2001年全球基因作物种植面积达5260万公顷。l转基因耐贮藏番茄l转查尔酮合成酶基因矮牵牛l抗病毒甜椒l抗病毒番茄l抗虫棉l近20年，对植物的快速繁殖与脱毒、种质保存、次生物质生产、细胞工程和基因工程等生物技术育种、以及遗传学和生物学基础理论进行了广泛的研究。（一）材料范围的逐步扩大器官 组织、细胞、原生质体低等苔鲜 高等植物l静止 液体振荡或旋转改善o2悬浮培养

8、、深层培养l小量 大量l试管 大罐l手工 自动化l随着化学工业发展而迅速发展l各种配方以成品方式出售新型显微镜新型分子标记新型倍性分析仪（fcm） totipotency: the ability of undifferentiated plant tissues to differentiate into functional plants when cultured in vitrol细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。l受精卵：可以产生具有完整形态和结构和功能的植株。l体细胞：也具备遗传信息的传递、转录和翻译的能力。competency（

9、再生作用）（再生作用）: the endogenous potential of a given cell or tissue to develop in a particular wayplant cell and tissue culture: cultural techniques for regeneration of functional plants from embryonic tissues, tissue fragments, calli, isolated cells, or protoplastsdefinitions plant cells are totipotent

10、; have the ability to develop into whole plants or plantorgans in vitro when given the correct conditions not all plant cells are totipotent. however, there are asufficient number of totipotent cells in the plant (e.g. in the pith木髓) differentiated cells have to be dedifferentiated into callus and r

11、edifferentiated back to somatic embryo that will regenerate the entire plant is a natural response of the plant tissue to wounding a mass of actively dividing undifferentiated cells producedby plant tissue explant cells are totipotent callus can be resuspended in liquid media to create a susupension

12、culture of single totipotent cells or differentiated into plant with the appropriatemanipulations of culture conditions(1) 器官发生（organogenesis），通常由培养的组织或细胞产生愈伤组织（callus），再产生芽和根。 (2) 胚胎发生（somatic cell embryogenesis），即由培养的组织产生愈伤组织，通过悬浮培养，或直接产生大量胚状体（embryoid），再长成植株。通过胚状体培养可以得到大量的植株。 organogenesis: the p

13、rocess of initiation and development of a structure that shows natural organ form and/or function. embryogenesis: the process of initiation and development of embryos or embryo-like structures from somatic cells (somatic embryogenesis).adventitious bud of aloe 芦荟adventitious product from callus of o

14、rchid1通过茎尖培养产生大量腋芽植物茎尖部分是分生组织区，是产生植物组织地上部分的全能性区域。叶脉分生组织受到顶端优势（apical dominance）的抑制，而调整细胞分裂素浓度，可以促进腋芽的生长。培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添加长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果需要使用激素，一定要严格外源激素，如果需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。控制浓度，以防止产生愈伤组织。例：唐菖蒲 6 weeks + ba 0.5 mg/l 长主芽 + ba 1 mg/l 1个侧芽 + b

15、a 2 mg/l 3个侧芽例：菊花 ba增加，腋芽的萌发量增加。 naa减少，腋芽的萌发量增加。2通过器官培养直接诱导不定芽从现存的芽以外的从现存的芽以外的任何器官、组织任何器官、组织上通过器官发生上通过器官发生重新形成的芽称重新形成的芽称为不定芽。为不定芽。特点：繁殖系数高，特点：繁殖系数高， 遗传稳定性较好。遗传稳定性较好。 但继代次数有限。但继代次数有限。3通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽 l接种的组织或器官小块在培养基上生长，去分化形成愈伤组织；为诱导愈伤组织生长，采用较强的生长素浓度。l多数植物的愈伤组织需要低生长素含量，高细胞分裂素浓度的培养基才会分

16、化产生不定芽，且有的在不含生长素的培养基上也可以分化。所有植物通过组织培养均可诱导愈伤所有植物通过组织培养均可诱导愈伤组织，进一步分化即可获得小植株。组织，进一步分化即可获得小植株。该途径经历了组织培养技术的所有该途径经历了组织培养技术的所有过程过程( (愈伤组织诱导愈伤组织增殖愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株芽分化生根完整植株) )，它属，它属于真正意义上的组织培养。于真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可通过此途径获得组培苗。物，均可通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高，繁殖系数大，但其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳

17、定性较差。对品种要求遗传遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁。径快繁。 is a natural response of the plant tissue to wounding a mass of actively dividing undifferentiated cells produced by plant tissue explant cells are totipotent callus can be resuspended in liquid media to create a suspension culture of

18、 single totipotent cells or differentiated into plant with the appropriatemanipulations of culture conditionscell suspension culture增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外( (人人工种子工种子) )，这一途径还没有用于快繁技术。，这一途径还没有用于快繁技术。 basis for plant tissu

19、e culture two hormones affect plant differentiation: auxin: stimulates root development cytokinin: stimulates shoot development generally, the ratio of these two hormones can determine plant development: auxin cytokinin = root development cytokinin auxin = shoot development auxin = cytokinin = callu

20、s developmentl再生作用（competency）植物内在的通过某个器官（根、茎、叶等）发育成完整植株的能力。1扦插的园艺植物有100多种。枝插：梅、葡萄、菊花等；叶插：秋海棠、卷柏、月季；根插：柿、树莓。2受伤的部位往往可产生新的器官：如长出不定芽，或不定根。3再生：主要取决于内源激素调整是否快或完全。1合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；2体细胞生长（类似），开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，首先要经过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形

21、态建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）最常见的再分化是根的形成：3 种方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，较易产生根；（3）同时产生芽和根。l一般而言，芽和茎叶原基起源于组织培养中比较表层的细胞（外起源）l根原基则发生在组织较深处（内起源）l在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，而成为完整的植株。l有分化胚状体能力的种子植物已有117种（分属于34科，75属）。胚状体可从以下几种培养物中产生：1直接从器官上发生；2从愈伤组织上发生；3从游离的单细胞发生；4从小孢子发生。 诱导胚状体与诱导芽相比，有3个显著优点：1 数量多、速度快、结构完

22、整；2 胚状体以单细胞直接分化成小植株，比经过愈伤组织再分化要快；3 胚状体一旦形成即可再生小植株，成苗率高。factors affecting plant tissue culture growth media minerals, growth factors, carbon source, hormones environmental factors light, temperature, photoperiod, sterility, media explant source usually, the younger, less differentiated the explant, t

23、he better for tissue culture genetics different species show differences in amenability to tissue culture in many cases, different genotypes within a species will have variable responses to tissue culture; response to somatic embryogenesis has been transferred between melon cultivars through sexual

24、hybridization实验室设置实验室设置基本技术基本技术培养基及其配制培养基及其配制外植体接种培养外植体接种培养实验室组成实验室组成基本设备配置基本设备配置培养容器与用具培养容器与用具实验室的基本要求实验室的基本要求实验准备实验准备包括培养基配制，包括培养基配制，洗涤与灭菌等洗涤与灭菌等无菌操作无菌操作控制培养控制培养culture roomculture roompreparation preparation roomroomsterile sterile roomroomsterile sterile operationoperationcytology cytology roomr

25、oomtransi-transi-tion areation area实验室布局示意图实验室布局示意图 准备室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。止空气对流。 培养室培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要

26、求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。室应保持干燥和清洁。细胞学实验室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。污染。摄影室及暗室摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建在

27、以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。时进行取样检查。 基本设备基本设备灭菌设备灭菌设备光照培养室与设备光照培养室与设备无菌操作设备无菌操作设备细胞学鉴定设备细胞学鉴定设备天平天平 ，冰箱，冰箱 ，酸度计酸度计 ，纯水器，纯水器 活性成分过活性成分过滤灭菌滤灭菌接种工具随接种工具随时消毒时消毒培养基灭菌培养基灭菌玻璃器皿灭菌玻璃器皿灭菌防止空气对流定期消毒保持干燥,控制光照和温度精确培养使用特殊设备l玻璃容器玻璃容器l塑料容器塑料容器l金属用具金属用具l塑料用具塑料用具倒置显微

28、镜倒置显微镜研究显微镜研究显微镜激光共激光共聚焦聚焦显微操作仪显微操作仪1培养基是组织培养最重要的基质。2培养基的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。3国际上常用的五种培养基：ms：murashige 和skoog (1962)mt: murashige 和和tucker (1969)er：eriksson（1965）b5：gamborg等（1968）sh：shenk和hildebrandt（1972）he：heller（1953）lms（murashige和skoog 1962）lm6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养lmiller（1963）：一般组织培养lh（bowgin

29、和nitsch）：一般组织培养lt（一般组织培养）lwhite（1963）：一般组织培养lb5（gamborg et al 1968）一般组织培养lc17（王培等1986）：小麦花药培养lw14（欧阳俊闻等1988）：小麦花药培养lkm8p（kao et al 1975）：原生质体培养llloyd and mccoun（lloyd 1980）：木本植物培养lrm（reinent et al 1967）：兰花l4各培养基特点lms：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。ler：与ms相似，磷酸盐的含量比ms高一倍，微量元素含量低得多。lb5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。ls

30、h：与b5相似，无机盐的含量稍高。lhe：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。主要为五大类：水无机盐有机化合物培养体支持材料抗生素及中药天然复合物自来水重蒸馏水蒸馏水ln：硝态氮、铵态氮。lp：atp合成不可少，培养基中一般以po34的形式添加。lk、ca、mg、s：必须元素，浓度一般在13毫克分子较适合。fe：l有利于合成叶绿素，是植物细胞分裂和延长所必需的。l一般使用fe2(so4)3和fecl3，ph5.2以上时，成 f e ( o h )3的 不 溶 性 沉 淀 ， 常 以feso4.7h2o和naedta使用。mn、cu、zn、mu：组织培养常需要。1碳水化合物蔗糖：浓度为23%

31、，胚培养时，可加45%其它：葡萄糖、果糖、麦芽糖。2植物激素（1）植物生命活动中不可缺少的物质，主要是促进细胞分裂生长及诱导器官分化。（2）组织培养用的较多的有：iaa、naa、2,4-d、kt、ba。3. 维生素：维生素c、b1、b6、烟酸、叶酸、一般0.10.5 mg/l。 维生素c：可防止组织变褐； 维生素b1：与愈伤组织的产生和生活力 有密切关系； 维生素b6：对根的生长有促进； 烟酸：对植物代谢和胚的发育有作用。4肌醇：一般用量100 mg/l（1）对组织、细胞繁殖、分化有促进；（2）对细胞壁的形成有作用；（3）还可增强愈伤组织的生长。5氨基酸（1）对培养体的生长、分化起重要作用；（

32、2）但单独添加进往往起阻碍作用，几种混合时才有好的作用。（1）含氨基酸、激素、酶等复杂化合物，如；（2）对细胞和组织的增殖与分化有促进，但对器官分化不明显；（3）成分不清，一般应尽是避免使用。1椰乳 coconut milk（1）使用最多、效果最大的一种，浓度在1020%；（2）对愈伤组织和细胞培养有促进作用。2香蕉（1）黄熟的小香蕉，150200 g/l（2）对ph的缓冲作用大，主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进。3胳朊加水分解物（1）主要成分为氨基酸，浓度100200 mg/l。（2）受酶和酸的作用易分解。4马铃薯（1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200 mg/l。（2）对

33、ph缓冲作用大。5其它（1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。（2）遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。1琼脂（agar)（1）凝固剂，一般0.61%.（2）为防此有害物质毒害，可加110 g/l的活性炭。2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。防止内生菌，可加抗生物质。1. 为减少工作量，一般配制所需浓度高10-100倍的母液 (stock solution)；2配制母液，按所使用药品的类别，分别配成大量元素、微量元素、维生素等；3保存：无机成分在一起时，可能产生沉淀，应分别保存；4要用重蒸馏水，等级较高的化学纯或分析纯的药品，称量或定容要准确；5配好的母液瓶上注

34、明母液号、配制倍数、日期、及配1升培养基时应取的量。6低温下可保存几个月。大量元素配制成大量元素配制成10-2010-20的母液的母液微量元素配制成微量元素配制成100-200100-200的母液的母液激素单独配制成激素单独配制成mg/mlmg/ml的母液的母液培养用培养基按需要按比例加入培养用培养基按需要按比例加入成成 分分用量用量每升培养每升培养基用量基用量成成 分分用量用量每升培每升培养基用养基用量量1）母液母液（大量元素，（大量元素，20）g/5l2）ml母液母液（铁盐，（铁盐，100）mg/lmlnh4no3165.050feso4.7h2o2780.010kno3190.0na2.

35、edta.2h2o3730.0cacl2.2h2o44.03）有机成分（有机成分（100）mg/lmlmgso4.7h2o37.0肌醇肌醇1000010kh2po417.0烟酸烟酸5010母液母液（微量元素，（微量元素，100）(mg/l)ml盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇5010ki83.0010盐酸硫胺素盐酸硫胺素1010h3bo3620.00甘氨酸甘氨酸20010mnso4.4h2o2230.001）：大量元素母液配制时按表中的顺序进行混匀：大量元素母液配制时按表中的顺序进行混匀znso4.7h2o860.002）：）：混合贮存于混合贮存于5l的容量瓶中的容量瓶中na2moo4.2h2o25.00

36、3）：）：有机成分分别存放有机成分分别存放cuso4.5h2o2.50 cocl2.6h2o2.50 加重蒸馏水按序加母液生长调节物质加蔗糖熔琼脂1一般加0.11 n的hcl（或naoh）；2通常使用的ph值范围是5.56.5。ph在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。 由于外植体的吸收，引起培养过程中ph变化 高压灭菌引起ph变化1三种方法：虹吸式、滴管方法、漏斗；2分注适量，一般占试管或三角瓶的1/31/4；3不要把培养基粘到管壁；分注后马上用棉盖塞住，并做好标记。1灭菌（1）高压蒸气锅灭菌，压力0.81.1 kg/cm2，保持1520 min。（3）进行三天预培养，一般至多保存2

37、周。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至热至1504015040分钟，或分钟，或12021202小时。小时。金属器皿：干热灭菌。金属器皿：干热灭菌。接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，每醛加高锰酸钾，每100ml100ml甲醛加甲醛加5g5g高锰酸钾。高锰酸钾。 培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积培养基体积（mlml）灭菌温度灭菌温度（）灭菌时间灭菌时间（min.min.）202

38、050501211212020505050050012112125255005005000500012512535352洗涤（1）小口器皿：清水冲洗衣粉刷子刷自来水蒸馏水洗1次烘箱烘干（2）大口器皿：清洗前，要先浸泡2小时。 玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。力较强，冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。金属用品洗涤：金属用

39、品一般不宜用各种洗涤液洗金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。l生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起决定性作用。1吲哚乙酸（iaa）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2萘乙酸（naa）：可人工大量生产，高温高压下稳定，动能比iaa高3.7倍。32,4-d：可促进愈伤组织形成。根：对生长素最敏感，低浓度下105103ppm，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化

40、也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。1ga3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2ga3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。3ga3可刺激植物体内生长素的生物合成。ga3蛋白酶蛋白质色氨酸生长素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用。溶剂1水中直接溶解困难。iaa、naa、iba、2,4-d、ga3可先用少量95%酒精溶解，再加水；kt、ba等则可用0.11 n的hcl溶解，再加水。2也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一般用mg/l表示

41、。l使用量l1一般生长为0.0510 mg/l。细胞分裂素0.0520 mg/l 。l2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。l生长素/细胞分裂素 低 促进芽形成l生长素/细胞分裂素 高 促进根形成1举例说明国际上常用的几种培养基？2培养基一般由哪些成分组成，各成分有何作用？3培养基的配制程序？4生长素、ga3、细胞分裂素在培养中主要有哪些作用？micropropagationlgermplasm preservationlsomaclonal variation & mutation selection lembryo culturelhaploid &

42、dihaploid productionlindustrial products from cell cultureslthe art and science of plant multiplication in vitrolusually derived from meristems (or vegetative buds) without a callus stagetends to reduce or eliminate somaclonal variation, resulting in true cloneslcan be derived from other explant or

43、callus (but these are often problematic)lstage 0 selection & preparation of the mother plantsterilization of the plant tissue takes placelstage i - initiation of cultureexplant placed into growth medialstage ii - multiplicationexplant transferred to shoot media; shoots can be constantly dividedlstag

44、e iii - rootingexplant transferred to root medialstage iv - transfer to soilexplant returned to soil; hardened offlclonal reproductionway of maintaining heterozygozitylmultiplication stage can be recycled many times to produce an unlimited number of clonesroutinely used commercially for many ornamen

45、tal species, some vegetatively propagated cropsleasy to manipulate production cyclesnot limited by field seasons/environmental influencesldisease-free plants can be producedhas been used to eliminate viruses from donor plants外植体外植体清洗整理清洗整理杀菌剂灭菌杀菌剂灭菌无菌水清洗无菌水清洗不同外植体不同外植体在灭菌剂浓度、在灭菌剂浓度、时间、程序上时间、程序上应有所区别

46、应有所区别消 毒 剂 使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易次氯酸钙/纳10530好易新洁尔灭1020530好易氯化汞0.11210最好最难过氧化氢1012515较好最易抗菌素450mgl-13060较好较难几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较lextension of micropropagation techniquesltwo methods:slow growth techniquesoe.g.: temp., light, media supplements (osmotic inhibitors, growth retardants), tissue deh

47、ydration, etcomedium-term storage (1 to 4 years)cryopreservationoultra low temperaturesostops cell division & metabolic processesovery long-term (indefinite?)1.details to follow on next two slides lpreculturingusually a rapid growth rate to create cells with small vacuoles and low water contentlcryo

48、protectionglycerol, dmso, peg, etc, to protect against ice damage and alter the form of ice crystalslfreezingthe most critical phase; one of two methods:lslow freezing allows for cytoplasmic dehydrationlquick freezing results in fast intercellular freezing with little dehydrationlstorageusually in l

49、iquid nitrogen (-196oc) to avoid changes in ice crystals that occur above -100oclthawingusually rapid thawing to avoid damage from ice crystal growthlrecovery (dont forget you have to get a plant)thawed cells must be washed of cryoprotectants and nursed back to normal growthavoid callus production t

50、o maintain genetic stabilitysomaclonal variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by a tissue culture process. most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered.lthe source for

51、 most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related species, or in an unrelated organismltotal sources of variation: mutation, hybridization, polyploidylsomaclonal variation is a general phenomenon of all plan

52、t regeneration systems that involve a callus phaselthere are two general types of somaclonal variation:heritable, genetic changes (alter the dna)stable, but non-heritable changes (alter gene expression, aka epigenetic)lsince utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to c

53、onsider mutation breeding in more detail lphysical mutagens (irradiation)neutrons, alpha raysldensely ionizing (“cannon balls”), mostly chromosome aberrationsgamma, beta, x-rayslsparsely ionizing (“bullets”), chromosome aberrations & point mutationsuv radiationlnon-ionizing, cause point mutations (i

54、f any), low penetratinglchemical mutagens (carcinogens)many different chemicalslmost are highly toxic, usually result in point mutationslcallus growth in tissue culturesomaclonal variation (can be combined with other agents)lcan screen large number of individual cellslchromosomal aberrations, point

55、mutationslalso: uncover genetic variation in source plantltreat seed with mutagen (irradiation or chemical)ltarget: 50% killlgrow-out m1 plants (some call this m0)evaluation for dominant mutations possible, but most are recessive, so lgrow-out m2 plantsevaluate for recessive mutationsexpect segregat

56、ionlprogeny test selected, putative mutantsprove mutation is stable, heritableluse plant cultures as starting materialidea is to target single cells in multi-cellular cultureusually suspension culture, but callus culture can work (want as much contact with selective agent as possible)loptional: appl

57、y physical or chemical mutagenlapply selection pressure to culturetarget: very high kill rate, you want very few cells to survive, so long as selection is effectivelregenerate whole plants from surviving cellsladvantagesscreen very high populations (cell based)can apply selection to single cellsldis

58、advantagesmany mutations are non-heritablerequires dominant mutation (or double recessive mutation); most mutations are recessivelcan avoid this constraint by not applying selection pressure in culture, but you loose the advantage of high through-put screening have to grow out all regenerated plants

59、, produce seed, and evaluate the m2lalternative: perform on haploid cell lineslseedlessness, maturation time: citruslherbicide resistance and tolerancelspecific amino acid accumulatorsscreen for specific amino acid productione.g. lysine in cerealslabiotic stress toleranceadd or subject cultures to s

60、election agente.g.: salt tolerance, temperature stresses, etcldisease resistanceadd toxin or culture filtrate to growth mediaexamples shown on next slide croppathogentoxinalfalfacolletotrichum sp.culture filtratebananafusarium sp.fusaric acidcoffeecolletotrichum sp.partially purified culture filtrat