焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法幻灯片

1、焦磷酸测序用于猪流感检测的意义从2009年3月开始，陆续在墨西哥和美国发现人感染猪甲型H1N1流感后改为A（H1N1）疫情，目前已很多国家发现疑似病例 ，我国也确诊了两例焦磷酸测序用于猪流感检测的意义焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 流感病毒在检测中存在的问题传统的检测方法如病毒分离鉴定虽具特异性，但是检测周期特别长，常常需要两周或两周以上的时间，无法满足出入境检验检疫的需要； 国务院生物安全管理条例已经实施，按条例规定病原分离鉴定只能在相应级别的生物安全实验室内进行，但目前检验检疫系统内还没有经过认可的P3实验室用于动物检疫，也就是说使用病毒分离鉴定确证阳性结果属非法。焦磷酸测序用于猪流感检测

2、的意义焦磷酸测序用于猪流感检测的意义国务院病原微生物实验室生物安全管理条例国务院病原微生物实验室生物安全管理条例第三章第三章第二十三条规定第二十三条规定出入境检验检疫机构在实验室开展检测、诊断工作时，发现高致病性病原微生物或者疑似高致病性病原微生物，需要进一步从事这类高致病性病原微生物相关实验活动的，应当依照规定经批准同意，并在取得相应资格证书的实验室中进行。为贯彻条例的规定，开展检测工作和亚型鉴定，需杜绝直接从事病原的研究。从分子水平上进行工作的开展，符合生物安全条例的精神。焦磷酸测序用于猪流感检测的意义RTPCR、荧光RTPCR此类方法虽特异灵敏，但可能存在假阳性反应。解决办法，目前对可疑

3、结果一般采用RTPCR产物序列测定进行确证。焦磷酸测序用于猪流感检测的意义焦磷酸测序技术分子诊断的黄金标准特异性、灵敏性远远低于病毒分离鉴定方法，可能存在假阳性反应。实时荧光实时荧光RT-PCRRTPCR测序确证遭遇瓶颈 瓶颈瓶颈：DNA序列测定做分子克隆，需要样品量大周期长，口岸采样一般采集咽喉试子，经实验前处理后，所剩样品较少，且病原含量较低，PCR产物量根本达不到传统测序所需要的量，无法进行测序工作。本课题的主要技术手段焦磷酸测序Pyro + Sequencing = Pyrosequencing 焦磷酸技术 测序技术 焦磷酸测序Pyrosequencing是将焦磷酸技术应用于DNA序列

4、分析的新一代技术分子水平上的研究最佳选择获得分子诊断的黄金标准基因序列测序焦磷酸测序用于猪流感检测的意义PPiATPAPSLuciferin硫酸化酶硫酸化酶双磷酸酶双磷酸酶荧光素酶荧光素酶lighttimePyrosequencing原理原理DNADNA聚合酶聚合酶l 实时和定量序列分析结果Sample sequence ：AGGCAGTTCGAC12345678910110-1 A GG C A GA GG C A G特点特点特特点点l 实验设计灵活Interest regionRPKHDFPBSeq Forward sequencing Reverse sequencing Multipl

5、esequencing primersInterest regionSeqRPBNNt gRcFP试验设计理念中心理念中心理念代表各亚型代表各亚型目标序列的目标序列的比对寻找比对寻找血凝素基因血凝素基因神经氨酸酶基因神经氨酸酶基因鉴于最新爆发鉴于最新爆发H1N1甲型甲型流感病毒变异点较多，流感病毒变异点较多，特选取该株独有且变异点较为特选取该株独有且变异点较为集中的区域作为目标序列集中的区域作为目标序列 实验步骤PCR检测双酶切检测目的基因目的基因阳性菌测序获得阳性克隆菌BioFlux回收试剂盒回收 连接与转化 RT-PCR引物设计引物设计提取模板提取模板灭活病原灭活病原 提取质粒M基因及亚型

6、基因的质粒构基因及亚型基因的质粒构建建采样及样品的处理采样及样品的处理鼻腔拭子 肌肉或组织脏器 应尽可能多保留一些样品，因为流感的特殊性，可能需要重复实验。RNA提取 采用常规方法 试剂只要适合于RNA提取即可试验进程（PCR）及电泳 直接进行H1、N1基因的PCR扩增l 采用两步法 电泳检测PCR扩增结果l 根据提供的扩增片段长度确定是否扩增到目标片段l 如有杂带，可以增加纯化步骤试验进程及结果试验进程及结果PCR试样预处理Pyrosequencing反应实验流程：分离纯化单链 开机，并拿出试剂，在使用前，保证所有试剂都达到室温 混匀 磁珠，在Mixer上常温混匀10分钟，每样约3L加入结合

7、缓冲液到50uL 将50 L标记有生物素的PCR产物与50 L链霉亲和素包被的磁珠混合，在室温25 下振荡孵育20 min。 用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗 30 s； 在70%乙醇中清洗5 s；变性缓冲液洗5 s；最后移到洗涤缓冲液中清洗10 s。 空吸附器放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80 烘箱2 min，再冷却到室温。Instrument designReagent cartridge96 well plateCCD cameraX-Y driveInk jet deliveryMixer and thermostatDetectionP

8、ositioningTACG实验流程： Pyrosequencing检测测序反应测序反应测序反应在28 下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。 标准的结构标准的结构 结果判定猪甲型H1N1流感病毒的确定： H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与H1、N1目标片段完全相同的，确定为猪甲型H1N1流感病毒亚型。 H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，H1和N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑，进行HA或NA基因全序列测定，确定其亚型。 H1、N1 RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判