1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理ppt课件[共31页]

1、PCRPCR技术及临床应用、新冠病毒技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理核酸检测原理 授课人：刘翔宇授课人：刘翔宇1目目 录录核酸基本知识核酸基本知识PCRPCR的发展史的发展史PCRPCR技术简介技术简介实时实时荧光荧光PCRPCR技术技术实时实时荧光荧光PCRPCR的临床应用的临床应用新冠病毒核酸检测原理新冠病毒核酸检测原理2一、核酸基本知识一、核酸基本知识 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志志 核酸的分类：脱氧核糖核酸（核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNADNA），核糖核酸（），核糖核酸（RNARNA）。）。DNADNA和和

2、RNARNA的区别在于：的区别在于：DNADNA所含的戊糖为脱氧核糖，而所含的戊糖为脱氧核糖，而RNARNA所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNADNA含胸腺嘧啶含胸腺嘧啶T T，而，而RNARNA含脲嘧啶含脲嘧啶U U。 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。和嘧啶碱）。 3核酸的基本结构核

3、酸的基本结构4遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则5DNADNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配对的原则进行半保留复制。配对的原则进行半保留复制。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction,PCRReaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的）是一种用于放大扩增特定的DNADNA片片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊殊DNADNA复制，复制，PCRPCR的最大特点是能将微量的的最大特点是能将微量的DNADNA

4、大幅大幅增加。增加。6二、二、PCRPCR的发展史的发展史19531953年，沃森和克里克发现了年，沃森和克里克发现了DNADNA双螺旋的结构，双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学化学, ,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。迅速发展。 19851985年美国年美国PE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mullis Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。19881988年初，年初，Keohano

5、gKeohanog改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，其扩增的其扩增的DNADNA片段很均一，真实性也较高，只有所片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种期望的一种DNADNA片段。但每循环一次，仍需加入新片段。但每循环一次，仍需加入新酶。酶。 719881988年年Saiki Saiki 等从温泉中分离的一等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌株水生嗜热杆菌(thermus (thermus aquaticus) aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合酶，此酶的发现使聚合酶，此酶的发现使PCRPCR广泛的被广泛的被应用。应用。实时荧光

6、定量实时荧光定量PCRPCR技术于技术于19961996年由年由美国美国Applied BiosystemsApplied Biosystems公司推出，公司推出，由于该技术不仅实现了由于该技术不仅实现了PCRPCR从定性到从定性到定量的飞跃，而且与常规定量的飞跃，而且与常规PCRPCR相比，相比，它具有特异性更强、它具有特异性更强、PCRPCR污染少、自污染少、自动化程度高等特点，目前已得到广动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。泛应用。8第一代：手动第一代：手动/ /机械手式水浴基因扩机械手式水浴基因扩增增用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在

7、三个温度：三个温度：PCRPCR的高温变性温度（如的高温变性温度（如9494）低温复）低温复性温度（如性温度（如5858），适温延伸温度（如），适温延伸温度（如7272）。）。再用一个装有再用一个装有PCRPCR标本试管的提篮，用手工在不同标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是因疲劳引起差错；而优点是: :设备简单，投资少，设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想

8、实验时间短，试验更接近理想PCRPCR反应条件反应条件。9第二代：自动化控制型第二代：自动化控制型PCRPCR 使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电泳的方式对泳的方式对PCRPCR产物进行分析，但存在着操产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。且无法对起始模板准确定量，险大等不足。且无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。无法对扩增反应实时检测。10第三代第三代PCRPCR：实时荧光定量：实时荧光定量PCRPCR为了避免上述传统为了避免上述传统PCRPCR的缺陷，并对基因的的缺陷，并对基

9、因的表达水平进行定量分析，表达水平进行定量分析，19921992年诞生了所年诞生了所谓谓“第三代第三代PCRPCR的荧光定量实时的荧光定量实时PCRPCR。 所谓所谓real-time Q-PCRreal-time Q-PCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个积实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。线对未知模板进行定量分析的方法。11第四代第四代PCRPCR：数字：数字PCRPCR 由于定量由于定量PCRPCR的分析最终结果依赖于的分析最终结果依

10、赖于CtCt值，在这个意义上所谓的值，在这个意义上所谓的“定定量量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字数字 PCRPCR应运而生。应运而生。 数字数字PCRPCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCRPCR，数，数字字PCRPCR可让你能够直接数出可让你能够直接数出DNADNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。分子的个数，是对起始样品的绝对定量

11、。 因此特别适用于依靠因此特别适用于依靠CtCt值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、果验证、miRNAmiRNA表达分析、单细胞基因表达分析等表达分析、单细胞基因表达分析等。12三、三、PCRPCR技术简介技术简介 高温可以使双链高温可以使双链DNADNA解链成为单链，解链成为单链，这一过程称为变性。这一过程称为变性。变性后的变性后的DNADNA通过降温可以重新接通过降温可以重新接合为双链，这一过程称为复性。合为双链，这一过

12、程称为复性。PCRPCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNADNA的天的天然复制过程，它的特异性取决于与然复制过程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。靶序列两端互补的寡核苷酸引物。13利用温度的升降来控制利用温度的升降来控制DNADNA的变性的变性和复性。和复性。设计引物作为启动序列，加入设计引物作为启动序列，加入DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP（三磷酸脱氧核甘酸）（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特定基因的体外复制。等原料完成特定基因的体外复制。周而复始的升降温度进行扩增，每周而复始的升降温度进行扩增，每一循环可以使靶序列增加一倍。一循环可以使靶序列增加一倍。

13、 14PCRPCR扩增步骤扩增步骤DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板在热作用下，氢键断裂，形成模板在热作用下，氢键断裂，形成单链单链DNADNA。 退火（退火（25-6525-65）：系统温度降）：系统温度降低，引物与低，引物与DNADNA模板结合，形成局模板结合，形成局部双链。部双链。延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的酶的作用下，以作用下，以dNTPdNTP（三磷酸脱氧核甘（三磷酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的酸）为原料，从引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补的延伸，合成与模板互补的DNADNA链。链。每一循环经过变性、

14、退火和延伸，每一循环经过变性、退火和延伸，DNADNA的含量既增加一倍。的含量既增加一倍。 15PCRPCR扩增示意图扩增示意图163030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,82417常用的技术常用的技术定性定性l电泳检测、放射自显影电泳检测、放射自显影l特异性差、易污染、只能定性特异性差、易污染、只能定性l特异性较好，极易污染、定量不特异性较好，极易污染、定量不准确准确终点法荧光终点法荧光l特异性很好，不易污染，定量线特异

15、性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好性范围小，重复性不好实时荧光实时荧光l特异性很好，不易污染，线性宽特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好重复性较好18四、实时四、实时荧光荧光PCRPCR技术技术 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR：在：在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量分析的方法。 定量定量PCRPCR仪是在普通仪是在普通PCRPCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检仪的基础上加装了荧光激发装

16、置和荧光检测装置，测装置，PCRPCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。所以有效地避免了样品间的交叉污染。19荧光荧光PCRPCR的原理的原理20实时实时荧光荧光PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念扩增曲线：反映扩增曲线：反映PCRPCR循环次数和荧光循环次数和荧光强度的曲线，定量强度的曲线，定量PCRPCR仪每次仪每次PCRPCR扩增扩增都会自动记录荧光强度的变化都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号定的一个值，它

17、可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要大于样本动计算，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于初阶段，并且保证回归系数大于0.990.99。CtCt值：值： PCR PCR扩增过程中，扩增产物的扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。扩增循环次数。21实时实时荧光荧光PCRPCR扩增曲线示意图扩增曲线示意图22手工调整荧光阈值示意

18、图手工调整荧光阈值示意图 23CtCt值的意义值的意义CtCt值与重复性值与重复性同一样本在相同条件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行9696次次扩增扩增CtCt值与浓度值与浓度不同浓度的模板达到荧光域值时不同浓度的模板达到荧光域值时的的CtCt值不同值不同24PCRPCR扩增的理论模式扩增的理论模式Yn=XYn=X* *(1+E)(1+E)n n ，0E10E1，E E为扩增效率为扩增效率,X,X为为原始模板数原始模板数,Y,Y为为PCRPCR产物的分子数量产物的分子数量,n,n为周为周期数。期数。模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越量越多，荧光达到域值的循环数越少，即少，

19、即CtCt值越小。值越小。LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品品CtCt值，就可以计算出样品中所含的模板量。值，就可以计算出样品中所含的模板量。25标准曲线的建立标准曲线的建立 梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。原始模板量的准确性。26实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的特点技术的特点灵敏度高灵敏度高特异性强特异性强快速简便快速简便应用范围广应用范围广27五、实时荧光五、实时荧光PCRPC