中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究

1、中国汉族人食管鳞状细胞癌中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究易感基因定位研究 河南省河南省林县、安阳、林县、安阳、新乡等新乡等显著的地域分布差异显著的地域分布差异 食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡30万人，也是中国万人，也是中国最常见的恶性肿瘤，排在中国恶性肿瘤死因的第四位最常见的恶性肿瘤，排在中国恶性肿瘤死因的第四位 有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达500倍倍杨氏家族杨氏家族家庭成员家庭成员:23, :23, 食管癌患者食管癌患者:15(65%):15(65%)明显的家

2、族聚集现象明显的家族聚集现象高癌家族高癌家族 林县林县 19651965年年高癌家族高癌家族 林县林县 20072007年年环境因素复杂环境因素复杂遗传因素明显遗传因素明显食管癌的病因尚不清楚食管癌的病因尚不清楚 遗传因素？遗传因素？ 环境因素？环境因素？问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？ 相互之间如何起作用？相互之间如何起作用？遗传遗传食管癌食管癌遗传和环境共同作用遗传和环境共同作用 gene a gene b gene c环境环境相互作用相互作用 与遗传相关的疾病分类与遗传相关的疾病分类单基因疾单基因疾病病多基因疾病多基因疾病体细胞遗传病体细胞遗传

3、病线粒体疾病线粒体疾病染色体疾病染色体疾病单基因遗传病单基因遗传病 单基因遗传病是指单基因遗传病是指单一单一基因突变基因突变引起的疾病引起的疾病 符合孟德尔遗传方式，符合孟德尔遗传方式，所以称孟德尔式遗传病所以称孟德尔式遗传病多基因遗传病多基因遗传病 多基因遗传病是由多基因遗传病是由多个微效基因多个微效基因与与环境因素环境因素共同作共同作用用所致所致, 遗传方式不遵循孟德尔遗传模式遗传方式不遵循孟德尔遗传模式癌症癌症糖尿病糖尿病高血压高血压冠心病冠心病精神分裂症精神分裂症 2003年年1953年年遗传学研究的三大里程碑遗传学研究的三大里程碑人类基因组研究第一次浪潮人类基因组研究第一次浪潮200

4、5年年n 多国参与的合作项目多国参与的合作项目n 构建不同人群的高密度构建不同人群的高密度snp图谱图谱n 确立确立snp在人群中的常见分布和传递模式在人群中的常见分布和传递模式n 每每1000个碱基对中有个碱基对中有1个个snp, 个体遗传信息有个体遗传信息有99.9%是相同，是相同，差异差异0.1%。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因n 为揭示人类的遗传机制，发现常见疾病相关基因提供方向；为为揭示人类的遗传机制，发现常见疾病相关基因提供方向；为发现复杂疾病易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术发现复杂疾病易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术

5、人类基因组单体型图计划人类基因组单体型图计划（hapmap计划）计划） gwas 基于基于“常见疾病，常见突变常见疾病，常见突变”学说，通过整个学说，通过整个人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的研究方法研究方法全基因组关联分析全基因组关联分析(gwas)?gwasgwas原理原理 atgcaagctgatcgatcgatcgcgaccatgcagcacctgactgcatgcaagctgttcgatcgatcgcgaccatgcagcacctgactgc病例病例对照对照原理：原理：在一定人群中，某个等位基因或在一定人群中，某个等位基因或基

6、因型在病例和对照组中存在差基因型在病例和对照组中存在差异，说明它与疾病有关联性异，说明它与疾病有关联性病例病例对照对照n 在病例中等位基因在病例中等位基因c c的频率明显高于对照的频率明显高于对照 提示：提示：等位基因等位基因c c与疾病存在一定关联性与疾病存在一定关联性55%35%45%65%30.25%12.25%20.25%42.25%45.5%49.5%gwasgwas举例举例 全基因组关联分析全基因组关联分析genome wide association studygwas优势优势gwasgwas癌症研究癌症研究(ng,2008-)(ng,2008-)已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺

7、、结直肠癌、已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺、结直肠癌、 黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、 卵巢癌和造血系统肿瘤等卵巢癌和造血系统肿瘤等食管癌：日本食管癌：日本1 1篇小样本文章篇小样本文章尚无中国汉族人食管癌尚无中国汉族人食管癌gwasgwas资料资料“863”计划将对威胁我国人口健康计划将对威胁我国人口健康的的5类常见重大疾病：精神疾病、类常见重大疾病：精神疾病、高血压、糖尿病、食管癌和肺癌高血压、糖尿病、食管癌和肺癌 进行全基因组关联分析研究。进行全基因组关联分析研究。选择选择tagsnps标记单体型标记单体型在病例在病例-对照

8、人群间对照人群间比较比较snps等位基因频率等位基因频率全基因组关联统计全基因组关联统计分析，得出有意义的分析，得出有意义的snps另外选择独立的病例另外选择独立的病例-对照人群对照人群对初筛阶段的结果进行验证对初筛阶段的结果进行验证gwasgwas技术路线技术路线hapmap计划计划初筛阶段初筛阶段重复验证阶段重复验证阶段利用芯片对所有利用芯片对所有tagsnps进行基因分型进行基因分型研究对象研究对象 中国汉族人群中国汉族人群 全部全部 21496 例例 初筛初筛 2810 例例（病例（病例 1077例例 / 对照对照 1733例）例） 验证验证 18686 例例（病例（病例 7673例例

9、 /对照对照 11013例）例）入组标准入组标准1. 资料详实完整资料详实完整2. 病例病例/对照为同一地区对照为同一地区3. 自愿参加自愿参加4. 病例组无治疗史病例组无治疗史5. 病例组病理证实病例组病理证实6. 食管癌分期按食管癌分期按uicc2007标准标准7. 对照组三代亲属中无食管癌病例对照组三代亲属中无食管癌病例8. 对照组经内镜检查除外早期食管癌对照组经内镜检查除外早期食管癌9. 不符合以上标准予以除外不符合以上标准予以除外资料及血样收集资料及血样收集45家医院：全国范围，华北为主家医院：全国范围，华北为主问卷调查：统一格式问卷调查：统一格式采集外周静脉血采集外周静脉血食管癌食

10、管癌gwas合作研究研讨会合作研究研讨会 2009.4.5-6安阳安阳dna提取及标化提取及标化qiagen（德国）基因组（德国）基因组dna提取试剂盒提取试剂盒按标准程序提取每份血样的按标准程序提取每份血样的dna准确测定每份待标化准确测定每份待标化dna的浓度的浓度 初筛浓度：初筛浓度：50ng/l，od值值1.8-2.0 验证浓度：验证浓度：15ng-20ng/l，od值值1.7-2.0基因分型和质控基因分型和质控 初筛：初筛：illumina human 610-quad芯片芯片 验证：验证：sequenom iplex 芯片芯片 具体步骤：具体步骤：（6）清洁芯片）清洁芯片（7）染色

11、）染色（8）芯片扫描）芯片扫描（9）数据质控）数据质控（1）制备）制备msa1板板（2）片段化）片段化（3）沉淀）沉淀（4）重悬）重悬（5）杂交）杂交 优势技术：综合了优势技术：综合了beadarraybeadarray高密度微阵列技术和高密度微阵列技术和goldengategoldengate多通道位点特异性延伸扩增检测方案多通道位点特异性延伸扩增检测方案 通量：一次分型的通量：一次分型的snpsnp位点达到位点达到5555万万6060万万, ,同时可同时可以定制自己感兴趣的位点以定制自己感兴趣的位点illuminaillumina分型芯片分型芯片统计学分析统计学分析 数据质控：计算样本得率

12、、数据质控：计算样本得率、snp得率、最得率、最小等位基因频率、哈迪小等位基因频率、哈迪温伯格遗传平衡吻温伯格遗传平衡吻合度检验合度检验 对质控后的数据用对质控后的数据用plink1.03软件分析软件分析 cochran-armitage 趋势检验：计算趋势检验：计算p值、值、优势比（优势比（or）和）和95%可信区间（可信区间（95%ci）初初 筛筛 50万个万个snps病例病例1077病例病例 937 对照对照1733 对照对照 692趋势检验趋势检验进入初筛进入初筛去除不匹配者去除不匹配者 80个个snps 18个个snps 2个个snps全基因组曼哈顿图全基因组曼哈顿图（937 病例病

13、例/692对照）对照）选选 点点选选 点点1818个个snpsnps s 2 2个个snpsnps s 病例病例 7673例例/对照对照11013例例 rs2274223 rs13042395验验 证证 研究了在目标研究了在目标snp和基因位点处相关区域的重组和链锁和基因位点处相关区域的重组和链锁不平衡类型不平衡类型 两个易感基因分别定位两个易感基因分别定位 phospholipase c epsilon 1 (plce1), 10q23 chromosome 20 opening reading frame 54 (c20orf54), 20p13基因定位基因定位两个易感基因和肿瘤密切相关两

14、个易感基因和肿瘤密切相关 plce1（磷脂酶基因亚运型）（磷脂酶基因亚运型）对多种恶性对多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有促进作用肿瘤的发生、发展、转移有促进作用 c20orf54（核黄素转运基因）（核黄素转运基因）调节人类核调节人类核黄素的转运，而核黄素缺乏是增加食管鳞黄素的转运，而核黄素缺乏是增加食管鳞状细胞癌发生的重要风险因子状细胞癌发生的重要风险因子plce1plce1蛋白表达在蛋白表达在不同病变组织差异显著不同病变组织差异显著0102030405060708090正常组织正常组织食管鳞癌食管鳞癌癌前病变癌前病变%p=2.08e-13阳性阳性阴性阴性结果提示结果提示 免疫组化发现随食管癌

15、变过程的进展，即免疫组化发现随食管癌变过程的进展，即正常正常癌前病变癌前病变浸润癌各级组织中浸润癌各级组织中plce1plce1蛋白阳性表达率逐渐升高蛋白阳性表达率逐渐升高 进一步提示：进一步提示：plce1plce1的遗传变异在食管癌变的遗传变异在食管癌变过程中起重要作用，过程中起重要作用，plce1plce1可能是中国汉族可能是中国汉族人食管鳞状细胞癌的致病基因人食管鳞状细胞癌的致病基因食管癌变各阶段免疫组化染色食管癌变各阶段免疫组化染色dysnor cisscc王立东，周福有，等王立东，周福有，等adh1badh1b位于位于4q21-234q21-23aldh2aldh2位于位于12q2

16、412q24两个基因都与酒精代谢有关两个基因都与酒精代谢有关日本日本食管鳞癌食管鳞癌gwas结果结果增加食管鳞癌发病风险增加食管鳞癌发病风险下一步工作计划下一步工作计划 增加样本量，再筛出几个易感基因增加样本量，再筛出几个易感基因 将所发现的易感基因在世界各地样将所发现的易感基因在世界各地样品进行验证，找出种族差异品进行验证，找出种族差异 进行现场研究，用于食管癌早筛进行现场研究，用于食管癌早筛 相关功能研究，靶向药物的研制相关功能研究，靶向药物的研制gwas临床应用临床应用重复验证重复验证明确基因和基因产物明确基因和基因产物确定功能确定功能开发基因靶向治疗药物开发基因靶向治疗药物开展个体化治疗开展个体化治疗开发诊断试剂开发诊断试剂为临床诊断服务为临床诊断服务设计预防干预手设计预防干预手段，证实基因对段，