生物制品分析概论

1、第二十章 生物制品分析制作人：沈阳药科大学 药学院 80K药物分析 陈丹丹 131080102生物制品的分类生物制品的质量要求鉴别试验生物制品检查内容目录目录CONTENTS第二十章 生物制品分析生物制品的分类第一节第一节CONTENTS第二十章 生物制品分析一、分类一、分类n 生物制品（生物制品（Biological ProductsBiological Products） 是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，术获得的微生物、细胞及各种动

2、物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。n根据用途分为三类根据用途分为三类 1 1）预防类：细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗）预防类：细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗 2 2）治疗类：抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子及）治疗类：抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子及DNADNA重组技术制品重组技术制品和单克隆抗体和单克隆抗体 3 3）诊断类：体内诊断类、体外诊断类）诊断类：体内诊断类、体外诊断类n根据所用材料、制法或用途分为以下几类：根据所用材料、制法或用途分为以下几类：第二十章 生物制品分析指用病毒或立克次体接种于动物、

3、指用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。制造而成。疫苗类药物疫苗类药物第二十章 生物制品分析一、分类一、分类抗毒素抗毒素：用细菌类毒素或毒素免疫马：用细菌类毒素或毒素免疫马或其它大动物所取得的免疫血清；或其它大动物所取得的免疫血清；抗菌或病毒血清抗菌或病毒血清：用细菌或病毒本身：用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所得免疫血清。免疫马或其他大动物所得免疫血清。 抗毒素及抗血清类药物抗毒素及抗血清类药物由健康人血浆或经特异免疫的人血浆，由健康人血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组经分离、提纯或由重组DNADNA技术制成的血技术制成的

4、血浆蛋白组分，以及血液细胞的有形成分。浆蛋白组分，以及血液细胞的有形成分。血液制品血液制品细胞因子类、生长因子类、激素类、细胞因子类、生长因子类、激素类、酶类、疫苗类、诊断制品。酶类、疫苗类、诊断制品。 重组重组DNADNA制品制品由有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的减毒由有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组活疫苗、灭活疫苗、重组DNADNA疫苗和亚单位疫疫苗和亚单位疫苗等。苗等。细菌类疫苗细菌类疫苗由病毒、衣原体、立克次体由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNADNA疫苗和亚单位疫苗等。疫苗和亚单位

5、疫苗等。病毒类疫苗病毒类疫苗指两种或两种以上疫苗原液按特定比例配指两种或两种以上疫苗原液按特定比例配合制成的具有多种免疫原性的疫苗。合制成的具有多种免疫原性的疫苗。联合疫苗联合疫苗由两个及以上同种但不同型（或群）抗由两个及以上同种但不同型（或群）抗原合并组成的含有双价或多价抗原成分原合并组成的含有双价或多价抗原成分的一种疫苗分别称。的一种疫苗分别称。 双价及多价疫苗双价及多价疫苗第二十章 生物制品分析疫苗类药物疫苗类药物n指用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造指用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。而成。生物制品的质量要求第二节第二节CONT

6、ENTS第二十章 生物制品分析安全性安全性有效性有效性可接受性可接受性第二十章 生物制品分析生物制品的质量要求生物制品的质量要求n生物制品的质量标准有别于其他商品，强调其特殊性。生物制品的质量标准有别于其他商品，强调其特殊性。使用安全，副作用小使用安全，副作用小。使用后能产生相应效力使用后能产生相应效力。制品的生产工艺、储存条件、制品的生产工艺、储存条件、成品的药效、稳定性、外观、成品的药效、稳定性、外观、包装、使用方法和价格可接受包装、使用方法和价格可接受。鉴别试验第三节第三节CONTENTS第二十章 生物制品分析免疫电泳法免疫电泳法免疫双扩散法免疫双扩散法免疫斑点法免疫斑点法免疫印迹法免疫

7、印迹法酶联免疫法酶联免疫法第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验n 系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个孔，在相邻系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个孔，在相邻两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后、在抗原与抗应，浓度、比例适当，则一定时间后、在抗原与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异性进行检查。的特异性进行检查。n ChP2010ChP2010收载的伤寒收载的伤寒ViVi多糖疫苗、狂犬病人免疫球多糖疫苗、狂犬病人免疫球蛋白和蛋白和人血白蛋白人血白蛋白等，

8、均采用该法进行鉴别。等，均采用该法进行鉴别。第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验n ChPChP人血白蛋白的鉴别人血白蛋白的鉴别1 1）将完全溶胀的）将完全溶胀的1.5%1.5%琼脂糖溶液倒于水平板上（每平方厘米加琼脂糖溶液倒于水平板上（每平方厘米加0.19ml0.19ml琼脂糖），凝固后打孔，直径琼脂糖），凝固后打孔，直径3mm3mm，孔距，孔距3mm3mm（方阵（方阵型）。型）。2 2）中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留一孔加入）中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留一孔加入相应阳性对照血清。每孔加样相应阳性对照血清。每孔加样2020

9、l l，然后置水平湿盒中，然后置水平湿盒中，3737水平扩散水平扩散2424小时。小时。3 3）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。4 4）将浸泡好的）将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入琼脂糖凝胶板放入0.5%0.5%氨基黑溶液中染色，用脱氨基黑溶液中染色，用脱色液脱色至背景无色，色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色沉淀线呈清晰蓝色为止。为止。应应仅与抗人血清或血浆产生沉淀线仅与抗人血清或血浆产生沉淀线，与抗马、抗猪、，与抗马、抗猪、抗牛、抗羊抗牛、抗羊血清或血浆不产生沉淀线。血清或血浆不产生沉淀线。n 系将供试品通过电泳分离成

10、区带的各抗原，然后与系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和性状进行比较，即可分析体生成的沉淀弧的位置和性状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。供试品中的成分及其性质。n ChP2010ChP2010收载的人血白蛋白和收载的人血白蛋白和冻干人免疫球蛋白冻干人免疫球蛋白等均等均采用该法进行鉴别。采用该法进行鉴别。第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验n

11、ChPChP冻干人免疫球蛋白的鉴别冻干人免疫球蛋白的鉴别1 1）将）将1.5%1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂糖凝胶板负极琼脂糖凝胶板负极1/31/3处的上下各打一孔，孔处的上下各打一孔，孔径径3mm3mm，孔距，孔距10-15mm10-15mm。2 2）测定孔加供试品溶液）测定孔加供试品溶液1010l l和溴酚蓝指示液和溴酚蓝指示液1d1d，对照孔加正常人，对照孔加正常人血清或血浆血清或血浆1010l l和溴酚蓝指示液和溴酚蓝指示液

12、1d1d。3 3）用三层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，）用三层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，100V100V恒恒压电泳月压电泳月2h2h（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距离两端月离两端月3-5mm3-5mm处挖宽处挖宽3mm3mm槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出。放湿盒中槽满但不溢出。放湿盒中3737扩散扩散2424小时。小时。3 3）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。4 4）将浸泡好的

13、）将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入琼脂糖凝胶板放入0.5%0.5%氨基黑溶液中染色，用脱色氨基黑溶液中染色，用脱色液脱色至背景无色。液脱色至背景无色。与与正常人血清或血浆比较，正常人血清或血浆比较，主要主要沉淀线应为沉淀线应为IgGIgG。n 系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。供试品的抗原特异性进行检查。n ChP2010ChP2010收载的重组人促红素注射液（收载的重组人促红素注射液（CHOCHO细胞）细胞）和注射用重组人干扰素和注射用重组人干扰

14、素1b1b等均采用该法进行等均采用该法进行鉴别。鉴别。第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验n 所用原理同免疫印迹法，但具体操作有所不同。所用原理同免疫印迹法，但具体操作有所不同。n 以供试品与特异性抗体结合后抗体再与酶标抗体以供试品与特异性抗体结合后抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。抗原特异性进行检查。n ChP2010ChP2010收载的收载的注射用重组人干扰素注射用重组人干扰素2a2a等，均等，均采用该法进行鉴别。采用该法进行鉴别。第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验n ChP2010ChP2010规

15、定规定抗毒素和抗血清制品抗毒素和抗血清制品鉴别试验采用鉴别试验采用酶联免疫法。酶联免疫法。n 如动感乙型脑炎灭活疫苗（如动感乙型脑炎灭活疫苗（VeroVero细胞）、人用狂细胞）、人用狂犬疫苗犬疫苗（VeroVero细胞）和重组乙型肝炎疫苗（酿酒细胞）和重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）等酵母）等均采用该法进行鉴别。均采用该法进行鉴别。第二十章 生物制品分析鉴别试验鉴别试验生物制品检查内容第四节第四节CONTENTS第二十章 生物制品分析效力检定效力检定n 浓度测定（含菌数或纯化抗原浓度测定（含菌数或纯化抗原量）量）n 活菌率或病毒滴定度测定活菌率或病毒滴定度测定n 动物保护率试验动物保护率试验n

16、免疫抗体滴定度和稳定性试验免疫抗体滴定度和稳定性试验安全性安全性n毒性试验毒性试验n防腐剂试验防腐剂试验n热原质试验热原质试验n有关安全性的特殊试验有关安全性的特殊试验生物制品检查内容生物制品检查内容第二十章 生物制品分析生物制品检查内容生物制品检查内容第二十章 生物制品分析n 物理性状的检查物理性状的检查n 蛋白质含量测定蛋白质含量测定n 防腐剂和灭活剂含量测定防腐剂和灭活剂含量测定n 纯度检查纯度检查n 相对分子质量或分子大小测定相对分子质量或分子大小测定n 其他：其他：水分含量测定、酸碱度和氯化钠测定水分含量测定、酸碱度和氯化钠测定n 安全检查安全检查n 生物制品的效力测定生物制品的效力

17、测定n 杂质检查杂质检查n 1.1.外观外观n 外观异常往往涉及制品的安全和效力问题；通过固定的外观异常往往涉及制品的安全和效力问题；通过固定的人工人工光源光源进行目测。进行目测。n 2.2.真空度及溶解速率真空度及溶解速率n 真空封口的冻干制品应测定真空度，瓶内应出现真空封口的冻干制品应测定真空度，瓶内应出现蓝紫色辉光蓝紫色辉光，溶解速度应在规定时限以下。溶解速度应在规定时限以下。n 3.3.装量装量n 通过通过容量法容量法测试其实际装量不得少于标示量。测试其实际装量不得少于标示量。”“一、物理性状的检查一、物理性状的检查第二十章 生物制品分析n 1.1.目的目的n 检查有效成分，计算纯度和

18、比活性。检查有效成分，计算纯度和比活性。n 2.2.常用测定方法常用测定方法n 凯氏定氮法凯氏定氮法（钨酸沉淀法和三氯乙酸沉淀法）、（钨酸沉淀法和三氯乙酸沉淀法）、酚试剂法酚试剂法（LoeryLoery法）和法）和双缩脲法双缩脲法（紫外（紫外- -可见分光光度法）等。可见分光光度法）等。”“二、蛋白质含量测定二、蛋白质含量测定第二十章 生物制品分析n 生物制品在生产中为了生物制品在生产中为了脱毒、灭火和防止活菌污染脱毒、灭火和防止活菌污染，常加入，常加入适量本分、甲醛、氯仿和汞制剂等作为适量本分、甲醛、氯仿和汞制剂等作为防腐剂和灭活剂防腐剂和灭活剂。n 对这些非有效成分，对这些非有效成分，Ch

19、P2010ChP2010中规定其含量应控制在一定限中规定其含量应控制在一定限度内。度内。”“三、防腐剂和灭活剂含量测定三、防腐剂和灭活剂含量测定第二十章 生物制品分析n 生物制品在经过精制后，要检查纯度是否达到规定要求，常用电泳生物制品在经过精制后，要检查纯度是否达到规定要求，常用电泳法和高效液相色谱法。法和高效液相色谱法。n ChPChP重组人促红素注射液（重组人促红素注射液（CHOCHO细胞）纯度测定细胞）纯度测定 1 1）亲水硅胶体积排阻色谱柱：排阻极限）亲水硅胶体积排阻色谱柱：排阻极限300kD300kD，孔径，孔径24nm24nm，粒度，粒度1010m m，直径，直径7.5mm,7.

20、5mm,长长30cm30cm； 2 2）流动相：）流动相：3.2mmol/L3.2mmol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠-1.5mmol/L-1.5mmol/L磷酸二氢钾磷酸二氢钾- -400.4400.4mmol/Lmmol/L氯化钠，氯化钠，pH7.3pH7.3； 3 3）上样量：）上样量：20-10020-100g g； 4 4）在波长）在波长280nm280nm处检测，以人促红素色谱峰计算旳理论板数不低于处检测，以人促红素色谱峰计算旳理论板数不低于15001500。按面积归一化法计算。按面积归一化法计算人促红素纯度，人促红素纯度，不低于不低于98.0%98.0%。”“四、纯度检查四、纯度检查

21、第二十章 生物制品分析n 对对提纯的蛋白质制品提纯的蛋白质制品如白蛋白、丙种球蛋白或抗毒素，在必如白蛋白、丙种球蛋白或抗毒素，在必要时需测定其单体、聚合体或裂解片段的要时需测定其单体、聚合体或裂解片段的相对分子质量及分相对分子质量及分子大小；子大小；n 提纯的多糖疫苗提纯的多糖疫苗需测定多糖的需测定多糖的分子大小及其相对含量。分子大小及其相对含量。n 常用方法：凝胶层析法常用方法：凝胶层析法 SDS-PAGESDS-PAGE法法 超速离心分析法超速离心分析法”“五、相对分子质量或分子大小测定五、相对分子质量或分子大小测定第二十章 生物制品分析第二十章 生物制品分析安全检查的对象安全检查的对象n

22、 菌毒种和主要原材料：菌毒种和主要原材料：1 1）用于生产的菌、病毒种，投产前必须按药）用于生产的菌、病毒种，投产前必须按药典或典或有关规定要求，进行毒力、特异性和培养特异性等试验，检查其生有关规定要求，进行毒力、特异性和培养特异性等试验，检查其生物学特性是否存在异常。物学特性是否存在异常。2 2）用于生产血液制品的血液，采血前必须对）用于生产血液制品的血液，采血前必须对献血者进行严格的体检和血样化验，采集血后还应进行必要的复查。献血者进行严格的体检和血样化验，采集血后还应进行必要的复查。n 半成品（包括原液）：半成品（包括原液）：在生产过程中，主要检查对活菌、活毒或毒在生产过程中，主要检查对

23、活菌、活毒或毒素的处理是否完善，半成品是否有杂菌或有害物质的污染，所加灭活剂、素的处理是否完善，半成品是否有杂菌或有害物质的污染，所加灭活剂、防腐剂是否过量等。防腐剂是否过量等。n 成品：成品：成品在分装或冻干后，必须进行出厂前的安全检查。逐批按药成品在分装或冻干后，必须进行出厂前的安全检查。逐批按药典三部或典三部或有关规定要求，进行无菌试验、纯菌试验、毒性试验、热原试有关规定要求，进行无菌试验、纯菌试验、毒性试验、热原试验和安全试验等检查，以确保制品的安全性。验和安全试验等检查，以确保制品的安全性。第二十章 生物制品分析安全检查的内容安全检查的内容杀菌、灭火和脱毒检查杀菌、灭火和脱毒检查过敏

24、性物质的检查过敏性物质的检查残余毒力和毒性物质残余毒力和毒性物质的检查的检查外源性污染的检查外源性污染的检查一些死菌苗、灭活疫苗以及类一些死菌苗、灭活疫苗以及类毒素等制品，需作检查：无菌毒素等制品，需作检查：无菌试验、活毒检查和解毒试验。试验、活毒检查和解毒试验。过敏性物质的检查过敏性物质的检查第二十章 生物制品分析过敏性试验过敏性试验n 采用采用异体蛋白为原异体蛋白为原料料制成的治疗制剂，制成的治疗制剂，需检查其中过敏源需检查其中过敏源的去除是否达到允的去除是否达到允许限度。许限度。n 豚鼠试验豚鼠试验牛血清含量的测定牛血清含量的测定n 主要用于检查主要用于检查组织培组织培养疫苗养疫苗，要求其含量，要求其含量不超过不超过50ng/50ng/剂。剂。血型物质的检测血型物质的检测n 用人胎盘血或静脉血用人胎盘血或静脉血准备的白蛋白和丙种准备的白蛋白和丙种球蛋白，常有少量球蛋白，常有少量A A或或B B型物质，型物质，O O型血孕型血孕妇使用后，可能引起妇使用后，可能引起新生儿溶血症新生儿溶血症。残余毒力检查残余毒力检查无毒性试验无毒性试验（一般安全试验）（一般安全试验）毒性检查毒性检查防腐剂检查防腐剂检查第二十章 生物制品分析残余毒力和毒性物质的检查残余毒力和毒性物质的检查外源性污染的检查外源性污染的检查第二十章 生物制品分析野毒检查野毒检查热原试验热原试验乙